velikost textu

Nukleární receptory - studium nových ligandů a význam genové variability

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Nukleární receptory - studium nových ligandů a význam genové variability
Název v angličtině:
Nuclear receptors – study of new ligands and influence of gene variability
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Alejandro Carazo Fernández, Ph.D.
Vedoucí:
Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
Oponenti:
doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D.
doc. Ing. Radim Vrzal, Ph.D.
Id práce:
216185
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
10. 10. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
ABSTRAKT V ČESKÉM JAZYCE Kandidát: Mgr. Alejandro Carazo Fernández Školitel: Prof. Petr Pávek, PhD. Název dizertační práce: Nukleární receptory – stadium nových ligandů a význam genové variability Nukleární receptory (NR) náleží do superrodiny transkripčních faktorů, které regulují expresi cílových genů. Nukleární receptory se dělí na steroidní receptory, „adopted orphan receptors“ a sirotčí receptory. Receptory, které nemají žádný identifikovaný endogenní ligand, jsou nazývány jako „sirotčí receptory“. Nukleární receptory hrají důležitou roli ve fyziologických procesech a jsou široce distribuovány po celém lidském těle. Jejich role je důležitá například při regulaci adipogeneze, glukoneogeneze, lipolýze, odpovědi na inzulín, oxidativním metabolismu, homeostáze mastných kyselin, homeostáze cholesterolu, homeostáze glykogenu a triglyceridů. Během své doktorské práce jsem testoval několik sad látek endogenní, přírodní a syntetické povahy na interakce s několika jadernými receptory se zaměřením zejména na konstitutivní androstanový receptor (CAR) a v menší míře na pregnanový X receptor (PXR). Mým hlavním cílem bylo najít nové a spolehlivé ligandy nebo aktivátory lidského CAR. Kromě toho, cílem bylo studovat mechanismus účinku, kterým tyto sloučeniny interagují s CAR receptorem a jakým způsobem regulují jeho cílové geny. Pro tento účel jsem použil ex vivo, in vitro a in silico modely. V první výzkumném projektu, který jsem prvoautorky publikoval, jsem popsal aktivaci lidského CAR několika flavonoidními látkami prostřednictvím inhibice receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR). Tento způsob nepřímé aktivace CAR receptoru byl popsán pro antiepileptikum fenobarbital (PB). Pro tento účel jsme použili několik metod, včetně tzv. assembly assay a LanthaScreen® TR-FRET metody. Ve druhém projektu jsem dále optimalizoval metodou TR-FRET, kterou jsem použil v předchozí výzkumné práci. Tato metoda je založena na přenosu fluorescenční rezonanční energie (FRET) mezi dvěma fluorofory, který mění emisního spektra v přítomnosti ligandu interagujícího vazebnou doménou CAR receptoru. Touto nebuněčnou metodou jsem detailně popsal interakce známých agonistů, antagonistů a inverzních agonistů s lidským CARem. Ve třetím výzkumném projektu jsem studoval interakce několika nově vyvinutých acetylovaných a oxidovaných derivátů žlučových kyselin s několika jadernými receptory v HepG2 buňkách. Ukázal jsem, že 3,12-diacetát deoxycholové kyseliny (DCA) je schopen silně aktivovat PXR a regulovat jeho cílové geny. Nicméně jsme nebyli schopni identifikovat tuto látku v lidské nebo myší žluči metodou HPLC, což naznačuje, že sloučenina není endogenní ligand PXR. V posledním výzkumného projektu jsem pracoval na mechanismu, který se podílí na interakci leflunomidu s lidským CAR. K dnešnímu dni žádné léčivo používané v humánní terapii nebylo identifikováno jako přímý aktivátor CAR receptoru s vysokou afinitou a jen látka CITCO vycházející strukturálně z oximu, je schopna stabilně aktivovat lidský CAR. Význam nalezení ligandů CAR receptoru je rozhodující pro studium aktivace CAR u lidí, jelikož zvířecí ortholog se značně od lidského liší. Věřím, že naše výsledky nám pomůžou pochopit, jak CAR, PXR a jiné jaderné receptory vykonávají své fyziologické a detoxifikační funkce v lidském organizmu. Kromě toho, náš výzkum vrhá trochu světla na pochopení molekulárních mechanismů, kterými jaderné receptory vykonávají svůj účinek a jak se podílejí na metabolismu a fyziologických procesech. Konečně, naše práce se pokusila aplikovat tyto znalosti při vývoji nových ligandů CAR receptoru i jiných nukleárních receptorů pro potenciální aplikaci v léčbě metabolických poruch.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT IN ENGLISH LANGUAGE Candidate: Mgr. Alejandro Carazo Fernández Supervisor: Prof. PharmDr. Petr Pávek, PhD. Title of the doctoral thesis: Nuclear receptors - new ligands study and importance of the genetic variability Nuclear receptors (NRs) constitute a superfamily of transcription factors, which regulate the expression of target genes upon the binding of a ligand. These receptors can be classified in steroid receptors, “orphan receptors” and “adopted orphan receptors” depending on the affinity to an endogenous ligand. Nuclear receptors play important roles in physiological processes and are widely distributed in the human body. Thus, adipogenesis, lipolysis, insulin sensitivity, oxidative metabolism, fatty acid homeostasis, cholesterol homeostasis, gluconeogenesis, glycogen homeostasis, triglyceride metabolism among other processes, are regulated by nuclear receptors. During my study, we have tested several sets of drugs, endogenous, natural and synthetic, in several nuclear receptors, focusing mainly on constitutive androstane receptor (CAR) and to a lesser extent on pregnane X receptor (PXR). My main aim was to find a new and reliable ligand or activator for human CAR. In addition, I aimed to study the mechanism of action by which these compounds interact with the receptor and how they trigger downstream pathways and target genes. For this purpose I used ex vivo, in vitro and in silico models. In the first research project, I described the human CAR activation by several flavonoid compounds via inhibition of epidermal growth factor receptor (EGFR). This way of indirect CAR activation was described for antiepileptic drug phenobarbital (PB), so we proposed that these flavonoids would interact with the receptor similarly. For this purpose, we employed several methods including CAR assembly assay in cultured cells and LanthaScreen® Time Resolved – Fluorescence Energy Transfer (TR-FRET) cell- free assay. In the second project, I optimized the TR-FRET method that we used in the previous research work. This method is based on the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between two fluorophores that change the emission spectrum upon presence of a ligand interacting with CAR ligand binding domain. In this work, I characterized well-known agonists, antagonists and inverse agonists of CAR employing the method. In the third research project, I studied interactions of a set of rationally developed acetylated and oxidized derivates of parent bile acids with several nuclear receptors in HepG2 hepatic cells. In this work, I established that derivate 3,12-diacetate DCA is able to strongly activate PXR and its target genes. However, we were not able to find traces of this derivate in human or mice bile samples with HPLC method suggesting that the compound is not an endogenous ligand of PXR. In the last research project, I am working on the mechanism, which is involved in interaction of leflunomide, a drug for the treatment of rheumatoid arthritis, with human CAR. To date, no drug used in human therapy has been reported to directly activate this receptor with high affinity and only CITCO (a toxic oxime) is able to stably activate human CAR. The importance of finding a CAR ligand among current medication is critical for the study of CAR activation in human beings. I believe our results will help us to understand how CAR, PXR and other nuclear receptors work. In addition, our research sheds some light on the understanding of the molecular mechanisms by which nuclear receptors exert their activity and how they are involved in metabolic and physiological processes. Moreover, our work aimed to apply this knowledge in the development of new ligands for the potential applications in therapy of metabolic diseases.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Alejandro Carazo Fernández, Ph.D. 7.93 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Alejandro Carazo Fernández, Ph.D. 412 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Alejandro Carazo Fernández, Ph.D. 406 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. 212 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D. 730 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Ing. Radim Vrzal, Ph.D. 448 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 87 kB