velikost textu

Studium regulace genové exprese nukleosidových transportérů v buněčné linii BeWo

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium regulace genové exprese nukleosidových transportérů v buněčné linii BeWo
Název v angličtině:
Study of gene regulation of nucleoside transporters in BeWo cell line
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Šárka Strachoňová
Vedoucí:
PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D.
Oponent:
Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
Id práce:
215857
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
21. 2. 2020
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
nukleosidové transportéry, koncentrační nukleosidové transportéry, proteinkináza A, cyklický adenosinmonofosfát, mitogenem aktivované proteinkinázy, extracelulárním signálem regulované kinázy, placenta, BeWo buněčná linie, genová exprese, PCR, regulace genové exprese
Klíčová slova v angličtině:
nucleoside transporters, concentrative nucleoside transporters, protein kinase A, cyclic adenosine monophosphate, mitogen-activated protein kinases, exctracellular signal-regulated kinases, placenta, BeWo cell line, gene expression, regulation of gene expression, PCR
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Studentka: Šárka Strachoňová Školitel: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Název diplomové práce: Studium regulace genové exprese nukleosidových transportérů v buněčné linii BeWo Nukleosidové transportéry (NTs) lokalizované v syncytiotrofoblastu zprostředkovávají vychytávání nukleosidů a podílí se na placentárním přestupu od nukleosidů odvozených léčiv. Dysregulace NTs může vést k ovlivnění nukleosidové homeostázy s negativním dopadem na vývin placenty a plodu a může vést ke změně placentární farmakokinetiky léčiv. Proto je porozumění exprese a funkce NTs nutná pro účinnou a bezpečnou farmakoterapii v období těhotenství. Cílem bylo studovat regulační dráhy genové exprese koncentračního nukleosidového transportéru 2 (CNT2) aktivované adenylátcyklázou (AC). K tomu byly použity dvě metody, qRT-PCR a in vitro akumulační zkoušky využívající modelový substrát [3H]-adenosin. Buněčná linie BeWo, odvozená od lidského placentárního choriokarcinomu, byla vystavena působení aktivátoru AC, forskolinu (50 μM) a/nebo inhibitorů signálních drah AC/cAMP/PKA a AC/cAMP/MAPK (MEK1/2 a p38 MAPK), tedy inhibitoru PKA, KT 5720 (5 μM), inhibitoru MEK1/2, U0126 (10 μM) a inhibitoru p38 MAPK, SB202190 (10 μM). Indukce genové exprese CNT2 způsobená forskolinem byla inhibovatelná KT 5720 a U0126. Aplikace jednotlivých inhibitorů však neovlivnila expresi genu v buňkách, které nebyly vystaveny forskolinu. Všechny testované inhibitory ale způsobily nižší vychytávání [3H]-adenosinu (inkubace 1 min), ale při inkubaci 15 min byl tento jev pozorován pouze u KT 5720. Lze tedy předpokládat, že inhibice drah cAMP/PKA, cAMP/MEK1/2 a cAMP/p38 MAPK vede k blokaci účinku forskolinu na CNT2 a zároveň tyto inhibitory pravděpodobně ovlivňují distribuci CNT2 do cytoplazmatické membrány. Nižší zastoupení CNT2 v membráně však ovlivňuje pouze rychlost vychytávání adenosinu, nikoliv jeho konečnou intracelulární koncentraci v delších časových úsecích. Nad rámec těchto zjištění jsme také popsali, že koncentrace glukózy či fetálního séra v kultivačním médiu neovlivňuje expresi CNT2. Tato práce přispěla k porozumění molekulárních mechanismů regulace CNT2 transportéru u BeWo linie.
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology & Toxicology Student: Šárka Strachoňová Supervisor: PharmDr. Lukáš Červený, Ph.D. Title of diploma thesis: Studium of gene regulation of nucleoside transporters in BeWo cell line Nucleoside transporters (NTs) localized in syncytiotrophoblast control placental uptake of nucleosides. Dysregulation of NTs can disrupt nucleoside homeostasis with a negative consequences on placental and fetal development and can lead to a change in placental pharmacokinetics of nucleoside-derived drugs. Therefore, understanding the expression and function of NTs is necessary for effective and safe pharmacotherapy during pregnancy. The aim of this diploma thesis was to study the adenylate cyclase (AC) activated regulatory pathways of gene expression of concentrative nukleoside transporter 2 (CNT2). For this purpose, qRT-PCR and in vitro accumulation assays using the model substrate [3H]-adenosine were employed. The human placental choriocarcinoma-derived BeWo cell line has been exposed to an AC activator, forskolin (50 µM), and/or inhibitors of AC/cAMP/PKA, AC/cAMP/MAPK (MEK1/2, p38 MAPK) signaling pathways, PKA inhibitor, KT 5720 (5 μM), an inhibitor of MEK1/2, U0126 (10 μM) and an inhibitor of p38 MAPK, SB202190 (10 μM). The application of inhibitors blocked the increase in expression of CNT2 gene caused by forskolin, but revealed no effect on CNT2 mRNA levels in FSK-nontreated cells. All tested inhibitors caused decrease in [3H]-adenosine uptake (1 min incubation), but in longer 15 min incubation this effect was observed only for KT 5720. In conlusion, inhibition of cAMP/PKA, cAMP/MEK1/2, cAMP/p38 MAPK pathways seems to block the effect of forskolin on CNT2, and these inhibitors likely affect CNT2 distribution into the cytoplasmic membrane. We hypothesize that the decreased levels of CNT2 in the membrane affects the rate of adenosine uptake, but not its final intracellular concentration over longer time periods. In addition to these findings we have also reported that the concentration of glucose or fetal serum in the culture medium doesn't affect CNT2 gene expression. This work contributed to the unterstanding of the molecular mechanism of CNT2 regulation in the BeWo cell line.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Šárka Strachoňová 1.52 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Šárka Strachoňová 117 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Šárka Strachoňová 120 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. 200 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 95 kB