velikost textu

Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Název v angličtině:
Study of regulatory mechanisms of selected protein kinases
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Bc. Olívia Petrvalská
Id práce:
213874
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Fyzikální chemie (NFYZD)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
3. 6. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
proteinkinasa, enzym, protein 14-3-3, ASK1, CAMKK
Klíčová slova v angličtině:
protein kinase, enzyme, the 14-3-3 protein, ASK1, CAMKK
Abstrakt:
Abstrakt Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo přístupnost této oblasti. Fyziologickým inhibitorem proteinkinasy ASK1 je i protein thioredoxin. Dalším výsledkem této disertační práce bylo zjištění, že tvorba cystinového můstku mezi Cys32 a Cys35 v katalytickém centru thioredoxinu je hlavním faktorem, který je odpovědný za disociaci komplexu thioredoxinu 1 s thioredoxin-vazebnou doménou ASK1 při oxidaci. Pro pochopení úlohy, kterou proteiny 14-3-3 hrají v regulaci proteinkinasy CaMKK2 byl na základě dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření navržen strukturní model komplexu proteinkinasy CaMKK2 s isoformou 14-3-3γ. Tento model naznačil, že v komplexu se katalytická doména CaMKK2 nachází mimo centrální kanál dimeru 14-3-3, přičemž 14-3-3γ přímo interaguje a ovlivňuje strukturu této domény CaMKK2, tedy mimo oblasti obsahující 14-3-3 vazebné motivy. Výsledky této práce potvrzují, že proteiny 14-3-3 jsou důležitými alosterickými modulátory proteinkinas ASK1 a CaMKK2.
Abstract v angličtině:
Abstract Through binding interactions with more than 300 binding partners, 14-3-3 proteins regulate large amount of biologically relevant processes, such as apoptosis, cell cycle progression, signal transduction or metabolic pathways. The research discussed in this dissertation thesis was focussed on investigating the role of 14-3-3 proteins in the regulation of two selected protein kinases ASK1 and CaMKK2. The main goal was to elucidate the mechanisms by which phosphorylation and 14-3-3 binding regulate functions of these protein kinases using various biochemical and biophysical methods, such as site-directed mutagenesis, enzyme activity measurements, analytical ultracentrifugation, small-angle X-ray scattering, chemical crosslinking, nuclear magnetic resonance and fluorescence spectroscopy. A structural model of the complex between the catalytic domain of protein kinase ASK1 with 14-3-3ζ, which was calculated using the small-angle X-ray scattering and chemical crosslinking data, suggested that this complex is conformationally heterogeneous in solution. This structural model together with data from time-resolved fluorescence and nuclear magnetic resonance suggested that the 14-3-3ζ protein interacts with the catalytic domain of ASK1 in the close vicinity of its active site, thus indicating that the complex formation affects the structure and/or the accessibility of the active site. Another important result of this thesis was the finding that the oxidation-induced disruption of interaction between ASK1 and thioredoxin 1, which is also a physiological inhibitor of ASK1, is mainly due to the disulfide bond formation between residues Cys32 and Cys35 in the catalytic site of thioredoxin. To understand the role of 14-3-3 proteins in the regulation of protein kinase CaMKK2, a structural model of the complex between CaMKK2 and 14-3-3γ was calculated based on small-angle X-ray scattering data. The model revealed that although the catalytic domain of CaMKK2 is located outside the central channel of the 14-3-3 dimer, the 14-3-3γ protein directly interacts with this domain and affects its structure outside regions containing 14-3-3 binding motifs. The results of this thesis confirmed that 14-3-3 proteins are important allosteric modulators of protein kinases ASK1 and CaMKK2.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Olívia Petrvalská 5.66 MB
Stáhnout Příloha k práci Bc. Olívia Petrvalská 11.29 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Olívia Petrvalská 222 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Olívia Petrvalská 215 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Jiří Vohlídal, CSc. 151 kB