velikost textu

Kinetická analýza enzymové aktivity modelových hemových senzorových proteinů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Kinetická analýza enzymové aktivity modelových hemových senzorových proteinů
Název v angličtině:
Enzyme activity analysis of function domains belonging to model heme-containing sensor proteins
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Bc. Veronika Fojtíková
Id práce:
213026
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
7. 6. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
histidinkinasa, hemové sensorové proteiny, fosfodiesterasa, diguanylátcyklasa
Klíčová slova v angličtině:
histidine kinase, heme-containing sensor proteins, phosphodiesterase, diguanylate cyclase
Abstrakt:
Abstrakt CZ Předkládaná disertační práce se zabývá studiem hemových senzorových proteinů, které detekují plynné molekuly. Tyto proteiny se nachází především v bakteriálních systémech, kde se podílí na regulaci procesů, jako např. sporulace, rezistence k antibiotikům a další. Hemové senzorové proteiny jsou tvořeny dvěma doménami – senzorovou, která obsahuje molekulu hemu, jenž interakcí s plynnými molekulami ovlivňuje aktivitu druhé, funkční domény. Součástí této práce je rešerše, která shrnuje poznatky ohledně problematiky hemových senzorů. V další části jsme se zaměřili na studium tří senzorových hemoproteinů, a to histidinkinasy AfGcHK, diguanylátcyklasy YddV a fosfodiesterasy EcDOS. Hlavním cílem předkládané práce bylo objasnit mechanismus intraproteinového/interdoménového přenosu signálu u hemových senzorových proteinů s globinovým uspořádáním senzorové domény (AfGcHK a YddV) s použitím kinetické analýzy enzymové aktivity a metod strukturní biologie. Dalším cílem bylo prozkoumat interproteinový přenos signálu mezi proteinem AfGcHK a jeho interakčním partnerem RR proteinem. V neposlední řadě byl zkoumán vlivu sulfidu sodného na katalytické vlastnosti proteinů EcDOS, AfGcHK. Výsledky kinetické analýzy odhalily, že redukce hemového železa a absence hemu v senzorové doméně výrazně snižuje enzymovou aktivitu hemových senzorů s globinovou strukturou. Strukturní analýzou bylo zjištěno, že redukce hemového železa u AfGcHK vyvolá strukturní změny v oblasti senzorové domény (helix H5), v dimerizační oblasti (helixy H6 a H7) a v oblasti funkční domény (helixy H9 a H11). Studiem interakce AfGcHK s RR proteinem bylo odhaleno, že v roztoku dochází k tvorbě komplexu dimeru AfGcHK a monomeru RR proteinu. Přítomnost RR proteinu v reakční směsi snižuje autofosforylační aktivitu AfGcHK, což naznačuje, že RR protein je vázán do blízkosti vazebného místa pro ATP. Interakční rozhraní těchto proteinů je tvořeno oblastmi v regulační doméně č. 1 RR proteinu a dimerizační oblasti AfGcHK. Přítomnost sulfidu sodného ovlivňuje spektrální vlastnosti všech zkoumaných hemových senzorových proteinů (EcDOS, AfGcHK, YddV). U mutantních forem Arg97Ile proteinu EcDOS a určitých mutantních forem Leu68 proteinu AfGcHK došlo k tvorbě tzv. verdohemu. U proteinu EcDOS došlo po inkubaci se sulfidem sodným ke zvýšení enzymové aktivity proteinu, u AfGcHK přítomnost sulfidu sodného neovlivnila enzymovou aktivitu proteinu.
Abstract v angličtině:
Abstract EN This Ph.D. thesis focuses on the heme containing gas sensor proteins. These proteins are predominantly present in bacteria, in which play an important role in processes like, sporulation, antibiotic resistance and so on. Heme containing sensor proteins composed of two domains. First one is a globin domain, which contains the heme molecule. Interaction of heme with gas molecule acts as a signal for the activation/inactivation of the second functional domain. Part of this thesis is formed by a review, which summarized the current knowledge about heme containing sensor proteins. In the next part of this thesis we focused on three representatives from the group of oxygen sensor proteins – histidine kinase AfGcHK, diguanylate cyclase YddV and phosphodiesterase EcDOS. The main aim of this thesis was to solve the mechanism of interdomain/intraprotein signal transduction in two oxygen sensor proteins with globin fold of their sensor domain (AfGcHK, YddV). For this purpose, we used the kinetic analysis of their functional domain activity and the methods of structural biology. We also studied the mechanism of interprotein signal transduction in AfGcHK and its cognate partner RR protein. It was also tested, how the presence of sodium disulfide affects the functional properties of oxygen sensor proteins EcDOS, AfGcHK. Kinetic studies reveal that the Fe(II) form and heme free form of the sensor globin domain exhibited low activity comparing to Fe(III) form. Major conformational differences between the active and inactive forms were observed in the sensor domain (helix H5), at the dimerization interface (helices H6 and H7) and also in the functional domain (helices H9 and H11). It was found, that in the relatively dilute solutions, AfGcHK and RR protein exist in the 2:1 complex (one dimeric AfGcHK and one monomeric RR protein). The presence of RR protein influences the autophosphorylation activity of AfGcHK, which suggest, that RR protein is bound close to the ATP binding site. The interaction interface of AfGcHK and RR protein is in the regulation domain 1 of the RR protein and in the AfGcHK’s dimerization domain. Presence of sodium disulfide influences the spectral properties of AfGcHK, EcDOS and YddV. In the case of Arg97Ile mutant of EcDOS and some of Leu68 mutants of AfGcHK the small proportion of verdoheme were formed after the treatment with sodium disulfide. The catalytic enhancement due to the presence of sodium disulfide was observed in the case of EcDOS, but not in the case of AfGcHK.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Veronika Fojtíková 69.36 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Veronika Fojtíková 114 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Veronika Fojtíková 115 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 152 kB