velikost textu

Mechanisms of resistance and iron metabolism in cancer stem cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mechanisms of resistance and iron metabolism in cancer stem cells
Název v češtině:
Mechanismy rezistence a metabolismus železa u nádorových kmenových buněk
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Sandra Lettlová
Id práce:
212348
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
4. 4. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Nádorové kmenové buňky; ABC transportéry; Metabolismus železa, MicroRNAs, Estrogenový receptor, Rezistence nádorů
Klíčová slova v angličtině:
Cancer stem cells; ABC transporters; Iron metabolism; MicroRNAs, Oestrogen receptor, Tumour resistance
Abstrakt:
Abstract (CZ) Rakovinné kmenové buňky (RKB), stejně jako normální kmenové buňky v tkáních, zodpovídají za zachování a růst nádorů. RKB představují malou frakci buněk uvnitř nádoru, která je charakteristická vlastní obnovovací kapacitou a schopností vyvolat nádor v myších s nefunkčním imunitním systémem. U buněk se zvýšenými kmenovými vlastnostmi se předpokládá, že jsou odpovědné za rezistenci nádorů k léčbě, tvorbu metastáz a návrat nádorového onemocnění. První část této práce se zabývá rezistencí nádorů, která je často spojena se zvýšenou expresí „ATP-binding cassete” (ABC) transportérů pumpujících chemoterapeutikum ven z buněk. Pro účely této studie jsme použili in vitro model RKB založený na kultivaci buněk jako tzv. 3D "sféry". Expresní profil ukazuje, že náš model RKB odvozený z buněčných linií rakoviny prsu a prostaty exprimuje celkově vyšší hladinu ABC transportérů, zejména ABCA1, ABCA3, ABCA5, ABCA12, ABCA13, ABCB7, ABCB9, ABCB10, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC5, ABCC8, ABCC10, ABCC11 a ABCG2. Analýza proteinové hladiny ABC transportérů v RKB prsu pak ukázala vyšší expresi transportérů ABCB8, ABCC1, ABCC2, ABCC10 a ABCG2 a naopak snížení hladiny proteinů ABCB10 a ABCF2. V souladu s těmito daty, sféry připravené z buněčných linií T47D a MCF7 vykazují rezistenci k daunorubicinu a doxorubicinu, a zajímavě také vyšší citlivost k inhibitorům transportérů ABCC1 a ABCG2. Tyto výsledky naznačují, že ABC transportéry mohou hrát důležitou roli při udržování fenotypu RKB, jež nesouvisí s transportem léčiv. Nádory rostoucí nezávisle na přítomnosti estrogenu často ztratí estrogenový receptor α (ERα), což je spojeno s horší prognózou pacientek. Tento proces může být regulován pomocí mikroRNA, 22 nukleotidů dlouhých, jednořetězcových, nekódujících RNA, které negativně regulují genovou expresi vazbou na mRNA, což vede k inhibici translace mRNA a její degradaci. Dále jsme zjistili, že onkogenní microRNA-301a-3p (miR-301a-3p) je vysoce zvýšená v našem modelu prsních RKB, které vykazují pokles ER signalizace. Ukázali jsme, že miR-301a-3p negativně reguluje ER signalizaci přímou represí translace mRNA kódující ERα. Vysoká exprese miR-301a-3p snižuje citlivost estrogen dependentních MCF7 buněk k 17-β estradiolu a podobně vede k inhibici růstu nádoru pocházejícího z této buněčné linie v nahých myších, které mají poškozený imunitní systém. Vzniklé nádory nicméně vykazují významně zvýšenou expresi genů souvisejících s fenotypem RKB a epiteliálně-mezenchymální tranzicí, naznačující obohacení populace nádoru o RKB. Navíc exprese miR-301a-3p negativně koreluje s hladinou exprese genu ESR1 u biopsií z pacientů s rakovinou prsu. MiR-301a-3p tak může sloužit jako ukazatel závislosti růstu nádoru na estrogenu a jeho rezistenci vůči anti- estrogenním lékům, ale také jako ukazatel prognózy pacienta. Poslední část této práce je zaměřena na metabolismus železa v RKB. Železo je nepostradatelným prvkem, který je nutný jako kofaktor pro normální funkci mnoha enzymových proteinů, které se účastní buněčného dýchání, Krebsova cyklu, redoxních reakcí, ale také replikace a opravy DNA. Není divu, že deregulace metabolismu železa vede k mnoha patologickým situacím, včetně nádorového bujení. Naše data ukazují, že sféry odvozené z buněčné linie MCF7 vykazují vyšší množství volného železa, vyšší příjem železa s jeho převažující akumulací v mitochondriích a jsou citlivější k chelaci železa. Sféry z MCF7 buněk také vykazují aktivaci IRP/IRE systému, což potvrzuje vyšší absorpci železa a snížení feritinově vázaných železových zásob. Aktivita enzymů obsahujících železo-sirné klastry je ve sférách snížena, což naznačuje narušení mechanismu jejich biogeneze. Dále MCF7 sféry vykazují vyšší oxidační prostředí, které je odrazem vyšší tvorby reaktivních druhů kyslíku a nižší hladiny redukovaného glutationu. Expresní profil genů spojených s metabolismem železa u RKB odvozených z buněčných linií rakoviny prsu a prostaty odhalil specifický expresní genový profil založený na rozdílné expresi genů souvisejících s vychytáváním železa (CYBRD1, TFRC), detekcí hladiny železa a její regulací (ACO1, IREB1), mitochondriální syntézou hemu a železo-sirných klastrů (ABCB10, GLRX5), hypoxií (EPAS1, QSOX1), exportem železa a regulací jeho exportu (HEPH, HFE), což poukazuje na značné změny v metabolismu železa u RKB. Analýza hlavních komponent založená na tomto genovém profilu je navíc schopna rozlišit RKB od ostatních nádorových buněk in vitro. Tato data tak dokumentují důležité změny metabolismu železa v souvislosti s fenotypem RKB. Závěrem lze konstatovat, že naše výsledky dále prohlubují poznatky o zásadní úloze RKB v biologii nádorů, přičemž vystihují rozdíly mezi normálními rakovinnými buňkami a RKB, které by mohly potenciálně sloužit při diagnostice nádorů a jejich léčbě.
Abstract v angličtině:
Abstract (EN) Analogously to normal stem cells within the tissues, cancer stem cells (CSCs) have been proposed to be responsible for maintenance and growth of tumours. CSCs represent a small fraction of cells within the tumour, which is characterised by self-renewal capacity and ability to give rise to a tumour when grafted into immunocompromised mice. Cells with increased stemness properties are believed to be responsible for tumour resistance, metastases formation and relapse after tumour treatment. The first part of this work concentrates on resistance of the tumours, which is often associated with increased expression of ATP-binding cassete (ABC) transporters pumping chemotherapeutics out of the cells. For the purposes of this study, we utilized an in vitro model of CSCs, based on cultivation of cells as 3D “spheres”. Expression profiling demonstrates that our model of CSCs derived from breast and prostate cancer cell lines express higher mRNA level of ABC transporters, particularly ABCA1, ABCA3, ABCA5, ABCA12, ABCA13, ABCB7, ABCB9, ABCB10, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC5, ABCC8, ABCC10, ABCC11 and ABCG2 among the cell lines tested. The protein level of ABC transporters tested in breast CSCs showed higher expression of ABCB8, ABCC1, ABCC2, ABCC10 and ABCG2 but downregulation of ABCB10 and ABCF2 proteins. Consistently, T47D and MCF7 spheres show resistance to daunorubicin and doxorubicin and interestingly, higher sensitivity to ABCC1 and ABCG2 inhibitors. These results suggest that ABC transporters may play an important role in maintenance of CSC phenotype unrelated to drug efflux. The transition from oestrogen dependent to oestrogen independent tumour growth in breast cancer is associated with loss of oestrogen receptor α (ERα) and is connected with worse prognosis. This process might be regulated by microRNAs, 22 nucleotides long, single stranded, non-coding RNAs that negatively regulate gene expression by binding to mRNA, resulting in translation inhibition and mRNA degradation. We found that oncogenic microRNA-301a-3p (miR-301a-3p) is highly elevated in our in vitro model of breast CSCs, which show a decrease in ER signalling. We demonstrated that miR-301a-3p negatively regulates ER signalling by direct repression of ERα mRNA translation. High miR-301a-3p expression decreases the sensitivity of oestrogen dependent MCF7 cells to 17-β oestradiol and similarly inhibits growth of the tumour derived from this cell line in nude mice. Yet, the resulting tumours show significantly increased expression of genes related to CSCs and epithelial to mesenchymal transition suggesting for enrichment of CSCs population. Moreover, miR-301a-3p expression negatively correlates with ESR1 level in biopsies from breast cancer patients. Thus, miR-301a-3p may serve as a prognostic marker of poor patient prognosis, oestrogen independency and resistance to anti-oestrogenic drugs. The last part of this work is focused on metabolism of iron in CSCs. Iron is indispensable micronutrient required as a cofactor for normal function of a plethora of proteins involved in cellular respiration, Krebs cycle, redox reactions as well as enzymes necessary for DNA replication and repair. Not surprisingly, deregulation of iron metabolism leads to many pathological situations including cancer. We show that MCF7 spheres exhibit higher labile iron pool, higher iron uptake with predominant mitochondrial iron accumulation and are more susceptible to iron chelation. MCF7 spheres also show activation of IRP/IRE system, explaining higher iron uptake and decrease in iron storage. Activity of iron sulphur cluster (ISC) containing enzymes in MCF7 spheres is lower suggesting for disruption of ISC machinery. Further, MCF7 spheres show higher oxidative environment reflected by higher level of reactive oxygen species and lower level of reduced glutathione. Gene expression profiling of CSCs derived from breast and prostate cell lines identified specific gene signature related to iron metabolism consisting of genes related to iron uptake (CYBRD1, TFRC), iron sensing and iron regulation (ACO1, IREB1), mitochondrial haem and ISC synthesis (ABCB10, GLRX5), hypoxia response (EPAS1, QSOX1), iron export and iron export regulation (HEPH, HFE), suggesting for profound changes in iron metabolism. Moreover, principal component analysis based on this signature is able to distinguish CSC from non-CSC population in vitro. Our findings show critical changes in iron metabolism related to CSC phenotype. Altogether, our results point to a critical role of CSCs in tumour biology, highlighting differences between normal cancer cells and CSCs that could be potentially used for cancer diagnostics and therapy.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Sandra Lettlová 7.03 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Sandra Lettlová 359 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Sandra Lettlová 356 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Zdena Palková, CSc. 151 kB