velikost textu

In vitro saturačné študie 99mTc-HYNIC-ramucirumabu na PC-3 bunkách

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
In vitro saturačné študie 99mTc-HYNIC-ramucirumabu na PC-3 bunkách
Název v češtině:
In vitro saturační studie 99mTc-HYNIC-ramucirumabu na PC-3 buňkách
Název v angličtině:
In vitro saturation study of 99mTc-HYNIC-ramucirumab on PC-3 cell line
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
František Lach
Vedoucí:
Mgr. Pavel Bárta, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Lucie Hyršová
Id práce:
211019
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biofyziky a fyzikální chemie (16-16110)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
8. 2. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Slovenština
Klíčová slova:
99mTc, HPLC, iTLC, PC-3, ramucirumab, saturace, VEGFR2
Klíčová slova v angličtině:
99mTc, HPLC, iTLC, PC-3, ramucirumab, saturation, VEGFR2
Abstrakt:
Abstakt v slovenskom jazyku Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biofyziky a fyzikálni chemie Študent: František Lach Školiteľ: Mgr. Pavel Bárta, PhD Konzultant: Mgr. Lucie Hyršová 99mTc-HYNIC-ramucirumabu Názov diplomovej práce: In vitro saturačné štúdie na PC- 3 bunkách V posledných rokoch sa zvyšuje počet zhubných nádorov v populácií. Z dôvodu častých vážnych nežiadúcich účinkov chemoterapeutických liečiv na celý organizmus sa do popredia dostáva cielená protinádorová terapia. Vďaka svojmu špecifickému účinku na regulačné a signálne dráhy proteínových štruktúr, sú k cieľovej protinádorovej terapii využívané monoklonálne protilátky. Medzi základné vlastnosti rastúceho nádoru patria vaskulogenéza (schopnosť novotvorby ciev z endoteliálnych prekurzorov) a angiogenéza (proces vlastnej novotvorby ciev). Medzi endoteliálne progenitory nádoru patri vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF). VEGF svoj biologický účinok aktivuje prostredníctvom väzby na svoje transmembránové tyrozínkinázové receptory VEGFR. Práve inhibícia receptorov vaskulárneho endotelového faktoru je cieľom niektorých monoklonálnych protilátok. Ramucirumab je monoklonálna protilátka, ktorá selektívne inhibuje VEGF receptor typu 2 (VEGFR-2) a tým blokuje aktivačné a signalizačné dráhy. Cieľom predkladanej diplomovej práce bolo zrealizovať nepriame rádioaktívne značenie monoklonálnej protilátky ramucirumab rádiodiagnostickým nuklidom 99mTc pomocou chelátoru succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamidu (HYNIC). U pripraveného rádiofarmaka 99mTc-HYNIC-ramucirumab sa overila rádiochemická čistota a stabilita po dobu 24 hodín. Rádiochemická čistota a stabilita bola overená pomocou metódy HPLC a iTLC. Rádiofarmakum sa otestovalo aj na biologické vlastnosti, teda zachovanie schopnosti sa viazať na cieľový receptor VEGFR-2 exprimovaného na nádorovej bunkovej línii ľudského prostatického karcinómu. In vitro experimenty boli zrealizované pomocou manuálnej saturačnej techniky a automatickej rádioimunoanalytickej metódy s detekciou v reálnom čase. Cieľom bolo zistenie hodnôt rovnovážnej disociačnej konštanty KD, ktorá určuje afinitu skúmanej látky k cieľovej proteínovej štruktúre. Výsledkom rádioaktívneho značenia monoklonálnej protilátky ramucirumab bola príprava stabilného rádiofarmaka 99mTc-HYNIC-ramucirumab, kde jeho pripravené vzorky vykazovali rádiochemickú čistotu vyššiu ako 95 %, čo je požiadavka Európskeho liekopisu pre aplikáciu rádiofarmak pacientom. Ani po 24 hodinách od zrealizovania rádioaktívneho značenia nebola zistená významná prítomnosť voľného technécia, ktorá by značila nestabilitu rádioaktívne značeného imunokomplexu. V in vitro experimentoch bola stanovená rovnovážna disociačná konštanta pre väzbu 99mTc-HYNIC-ramucirumab na VEGFR-2 v hodnote KD = 9,99 ± 2,06 nM pre manuálnu saturačnú techniku a KD = 1,54 ± 0,52 nM pre automatickú radioimunoanalýzu. Získané hodnoty in vitro štúdie tak potvrdili zachovanie väzbovej schopnosti rádioaktívne značenej monoklonálnej protilátky k bunkovému VEGFR-2. Výsledkom predkladanej diplomovej práce je potvrdenie možnosti rádioaktívne značiť monoklonálnu protilátku ramucirumab diagnostickým rádionuklidom 99mTc cez chelatačné činidlo HYNIC so súčasným zachovaním väzbových schopností pripraveného rádiofarmaka. Pripravený rádioaktívne značený komplex 99mTc-HYNIC-ramucirumab by sa mohol stáť sľubným ligandom pre vizualizáciu VEGFR-2 pozitívnych nádorových ochorení, ak by súčasne obstál aj v in vivo testovaní.
Abstract v angličtině:
Abstrakt v anglickom jazyku Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biophysics and Physical Chemistry Student: František Lach Supervisor: Mgr. Pavel Bárta, PhD Consultant: Mgr. Lucie Hyršová Title of diploma thesis: In vitro saturation study of 99mTc-HYNIC-ramucirumab on PC-3 cell line The number of malignant tumours in the population has increased in recent years. Due to the frequent serious sides effects of chemotherapeutic drugs on the whole organism, targeted antitumor therapy is at the forefront. Due to its specific effect on the regulatory and signal pathways of protein structures, monoclonal antibodies are used for the target anti-tumour therapy. The basic properties of the growing tumour include vasculogenesis (the ability to build new blood vessels from the endothelial precursors) and angiogenesis (the process of self-inducing formation of blood vessels). Endothelial tumour progenitors include vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF activates its biological activity by binding to its transmembrane tyrosine-kinase receptors VEGFR. Indeed, the inhibition of the vascular endothelial factor receptors is the target of some monoclonal antibodies. Ramucirumab is a monoclonal antibody that selectively inhibits VEGF receptor type 2 (VEGFR-2) and thereby blocking the activation and signalizing pathways. The aim of this diploma thesis was realised indirect radioactive labelling of the monoclonal antibody ramucirumab with the 99mTc radiodiagnostic nuclide using the succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide chelator (HYNIC). Radiochemical purity and stability of the prepared radiopharmaceuticals 99mTc-HYNIC-ramucirumab was verified for 24 hours. Radiochemical purity and stability was verified by HPLC and iTLC. Radiopharmaceuticals were also tested for their biological properties, therefore their ability to bind to the target receptor VEGFR-2, expressed on the tumour cell line of human prostate cancer. In vitro experiments were performed by using manual saturation technique and real-time radioimmunoassay. The aim was to find values of the equilibrium dissociation constant KD, which determines the affinity of the tested substance to the target protein structure. The result of radiolabelling of the monoclonal antibody ramucirumab was a preparation of a 99mTc-HYNIC-ramucirumab, of which prepared samples showed a radiochemical purity more than 95%, that is required in the European Pharmacopoeia for the application of radiopharmaceuticals to patients. No significant presence of free technetium was found to indicate the instability of the radiolabelled immunocomplex after 24 hours of the radioactive labelling. In in vitro experiments, the equilibrium dissociation constant for the binding of 99mTc-HYNIC-ramucirumab to VEGFR-2 was determined in values KD = 9.99 ± 2.06 nM for manual saturation technique and KD = 1.54 ± 0.52 nM for automatic radioimmunoassay. The values obtained for in vitro studies confirmed the binding ability of the radiolabelled monoclonal antibody to VEGFR-2. The result of this diploma thesis is the confirmation of the possibility of radiolabelling the monoclonal antibody ramucirumab with the diagnostic radionuclide 99mTc through the HYNIC chelating agent, with maintained binding abilities of the prepared radiopharmaceuticals. The prepared radiolabelled 99mTc-HYNIC-ramucirumab complex could become a promising ligand for visualizing VEGFR-2 of positive tumour diseases, if it also passed in vivo testing.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce František Lach 1.86 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce František Lach 130 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky František Lach 126 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. 96 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Lucie Hyršová 281 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 98 kB