text size

Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Zinc-Dependent Hydrolases: Structure-Function Study of Glutamate Carboxypeptidase II and Histone Deacetylase 6
Title (in czech):
Hydrolasy závislé na zinku: Studium struktury a funkce glutamátkarboxypeptidasy II a histondeacetylasy 6
Type:
Rigorosum thesis
Author:
Mgr. Ľubica Škultétyová, Ph.D.
Thesis Id:
210091
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Biochemistry (31-250)
Study programm:
Biochemistry (N1406)
Study branch:
Biochemistry (NBIOD)
Degree granted:
RNDr.
Defence date:
07/01/2019
Defence result:
Pass
Language:
English
Keywords (in czech):
GCPII, glutamátkarboxypeptidasa II, návrh hydrofobních inhibitorů, HDAC6, histondeacetylasa 6, deacetylace tubulinu, mikrotubuly, tubulinové dimery
Keywords:
GCPII, Glutamate Carboxypeptidase II, design of hydrophobic inhibitors, HDAC6, Histone Deacetylase 6, tubulin deacetylation, microtubules, tubulin dimers
Abstract (in czech):
ABSTRAKT Proteiny vázající zinek představují přibližně desetinu proteomu a významnou část z nich tvoří hydrolasy závislé na zinku. Tato disertační práce se zaměřuje na biochemickou a strukturní charakterizaci glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII) a histondeacetylasy 6 (HDAC6), které jsou členy rodiny metalohydrolas závislých na zinku, a popisuje interakce s jejich přirozenými substráty a inhibitory. GCPII je homodimerní membránová proteasa, která v centrální a periferní nervové soustavě katalyzuje odštěpení glutamátu z neuropřenašeče N-acetyl-aspartyl glutamátu (NAAG) a v tenkém střevě z folátů přijatých v potravě. Tento enzym je spojován s několika neurologickými poruchami a představuje také ideální cíl pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty. Inhibitory GCPII obvykle nesou skupinu vázající zinek a dále obsahují funkční skupinu specificky rozpoznávanou v S1’ místě enzymu (tvořenou glutamátovým zbytkem nebo jeho isosterem). Tyto sloučeniny jsou přirozeně hydrofilní molekuly, což brání jejich průniku přes hematoencefalickou bariéru a znemožňuje inhibici GCPII v centrální nervové soustavě. V této disertační práci představujeme různé strategie zaměřené na záměnu tradičního P1’ glutamátového zbytku nevětvenými neproteinogenními aminokyselinami a bioisostery glutamátu. Dále pak sledujeme vliv zavedení aminohexanového linkeru na afinitu a biologické vlastnosti inhibitorů na bázi fosforamidátů. Analýza krystalových struktur komplexů GCPII s těmito novými inhibitory odhalila dosud nepopsanou flexibilitu S1’ místa, která umožňuje proteinu GCPII vázat objemné zbytky. Identifikovali jsme nové inhibitory se zvýšenou lipofilicitou, které i když nejsou silnými inhibitory, mohou složit jako prekursory pro následní racionální návrh nových léčiv. Acetylace lysinu 40 v α-tubulinu chrání mikrotubuly před následky mechanického stárnutí a hraje i roli v pohybu buněk, větvení axonů a růstu a udržováni výběžků neuronů. HDAC6 je hlavní deacetylasou tubulinu a jeho význam jakožto možného cíle pro léčbu rakoviny a neurodegenerativních onemocnění stále roste. Tím pádem vzrůstá i potřeba hlubšího pochopení jeho interakce s tubulinovým substrátem. V této práci ukazujeme, že HDAC6 deacetyluje dimery tubulinu 1500 krát vyšší rychlostí než mikrotubuly. Naše data naznačují, že s výjimkou aminokyselin na pozicích P1 a P-1 přispívají aminokyseliny obklopující Lys40 k rozpoznávání substrátu minimálně, a že účinná deacetylace vyžaduje komplexní interakce s tubulinovým dimerem.
Abstract:
ABSTRACT Zinc-binding proteins represent approximately one tenth of the proteome and a good portion of them are zinc-dependent hydrolases. This thesis focuses on biochemical and structural characterization of glutamate carboxypeptidase II (GCPII) and histone deacetylase 6 (HDAC6), two members of the zinc-dependent metallohydrolase superfamily. We describe here their interactions with natural substrates and inhibitors. GCPII is a homodimeric membrane protease catalyzing hydrolytic cleavage of glutamate from the neurotransmitter N-acetylaspartylglutamate (NAAG) and dietary folates in the central and peripheral nervous systems and small intestine, respectively. This enzyme is associated with several neurological disorders and also presents an ideal target for imaging and treatment of prostate cancer. GCPII inhibitors typically consist of a zinc-binding group (ZBG) linked to an S1’ docking moiety (a glutamate moiety or its isostere). As such, these compounds are highly hydrophilic molecules therefore unable to cross the blood-brain barrier and this hampers targeting GCPII to the central nervous system. Different approaches are adopted to alter the S1’ docking moiety of the existing inhibitors. As a part of this thesis, we present different strategies relying on replacement of the canonical P1’ glutamate residue with unbranched non-natural amino acids and glutamate bioisosteres. We also study the effect of introduction of an aminohexanoate linker on affinity and biological properties of phosphoramidate-based inhibitors. Analysis of crystal structures of GCPII in the complex with these novel inhibitors identified unprecedented plasticity of the S1’ site that enables GCPII to accommodate bulky residues. We have succeeded in identifying compounds with increased hydrophobicity. These molecules, although not strong inhibitors, represent promising scaffolds for further rational design of new inhibitors. Acetylation of Lys40 of α-tubulin protects the microtubules from mechanical ageing and plays role in cell motility, axonal branching, and growth and maintenance of neuronal processes. HDAC6 is the major tubulin deacetylase and it is emerging as a possible treatment target in cancer and neurodegenerative diseases. A better understanding of its interaction with the tubulin substrate is therefore needed. We show here that HDAC6 deacetylates the tubulin dimers at a rate 1500-fold higher than the microtubules. Our data indicates that amino acids beyond the P1 and P-1 within the Lys40 loop contribute minimally to the substrate recognition and that efficient deacetylation requires complex longitudinal and lateral interactions with tubulin dimer.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Ľubica Škultétyová, Ph.D. 35.84 MB
Download Abstract in czech Mgr. Ľubica Škultétyová, Ph.D. 206 kB
Download Abstract in english Mgr. Ľubica Škultétyová, Ph.D. 127 kB
Download Defence's report prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 152 kB