velikost textu

Regulace transportu NMDA receptorů v savčích neuronech

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Regulace transportu NMDA receptorů v savčích neuronech
Název v angličtině:
Regulation of NMDA receptor trafficking in mammalian cells
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Katarína Lichnerová
Id práce:
208930
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Fyziologie živočichů (NFYZZIV)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
14. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
glutamátový receptor; granulární mozečkové neurony; HEK293 buňky; iontový kanál; intracelulární transport; endoplazmatické retikulum; N-glykosylace, biochemie, elektrofyziologie
Klíčová slova v angličtině:
glutamate receptor; cerebellar granule cells; HEK293 cells; ion channel; intracellular trafficking; endoplasmic reticulum; N-glycosylation; biochemistry; electrophysiology
Abstrakt:
Abstrakt N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory řadíme mezi ionotropní glutamátové receptory ovlivňující excitační synaptický přenos a synaptickou plasticitu v centrálním nervovém systému (CNS) savců. Aktivace NMDA receptorů hraje klíčovou roli ve vývoji mozku nebo při formování paměti. Abnormální regulace NMDA receptorů je jedna z hlavních příčin vzniku různých neurologických a psychiatrických onemocnění. NMDA receptory vytvářejí heterotetramerní komplexy složené z GluN1, GluN2(A-D) a/nebo GluN3(A a B) podjednotek. Povrchová exprese NMDA receptorů je regulovaná na mnoha úrovních, včetně zpracování a kontroly v endoplazmatickém retikulu (ER), intracelulárního transportu přes Golgiho aparát (GA), internalizace, recyklace a následné degradace. NMDA receptory jsou na úrovni časného transportu regulovány: volnou dostupností GluN podjednotek v ER, přítomností ER- retenčního a exportního signálu a posttranslačními modifikacemi, včetně fosforylace a palmitoylace. Avšak role N-glykosylace v regulaci transportu NMDA receptorů dosud nebyla plně objasněna. Cílem této práce proto bylo objasnění mechanismů regulace povrchové exprese a funkčních vlastností NMDA receptorů. V předložené práci jsme použili kombinaci nejmodernějších metod z oblasti molekulární biologie, mikroskopie, biochemie a elektrofyziologie. Rovněž jsme využili několik heterologních i nativních expresních systémů, včetně COS-7 a HEK293 buněk a kultur hipokampálních a granulárních mozečkových (CGC) neuronů, což nám umožnilo celistvý pohled na danou problematiku. Z výsledků naší práce vyplývá, že transport GluN1/GluN2C receptorů je regulovaný třemi specifickými oblastmi v rámci GluN2C podjednotky: i) oblastí A2 segmentu v amino-terminální doméně (ATD), ii) M3 doménou a iii) proximální částí C-terminální domény (CTD) obsahující sekvenci pěti aminokyselin, tvořících SLPSP motiv. Dále jsme zjistili, že: iv) pro regulaci transportu NMDA receptorů z ER na buněčný povrch je klíčová přítomnost dvou N-glykosylačních míst, N203 a N368. v) Po odstranění N-glykanů z nativních NMDA receptorů dojde ke změně afinity těchto receptorů ke glutamátu. vi) Mozečkové NMDA receptory asociují s 23 různými typy lektinů, které mají unikátní specificitu pro glykanové struktury a jsou schopné měnit biofyzikální vlastnosti těchto receptorů. vii) Většina predikovaných N-glykosylačních míst na GluN1 a GluN2B podjednotkách skutečně obsahuje glykanové struktury. Klíčová slova: glutamátový receptor; granulární mozečkové neurony; HEK293 buňky; iontový kanál; intracelulární transport; endoplazmatické retikulum; N-glykosylace, biochemie, elektrofyziologie
Abstract v angličtině:
Abstract N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors are a subclass of glutamate receptors that play an essential role in mediating excitatory neurotransmission and synaptic plasticity in the mammalian central nervous system (CNS). The activation of NMDA receptors plays a key role in brain development and memory formation. Abnormal regulation of NMDA receptors plays a critical role in the etiology of many neuropsychiatric disorders. NMDA receptors form a heterotetrameric complex composed of GluN1, GluN2(A-D) and GluN3(A, B) subunits. The NMDA receptors surface expression is regulated at multiple levels including early processing (synthesis, subunit assembly, endoplasmic reticulum (ER) processing, intracellular trafficking to the cell surface), internalization, recycling and degradation. NMDA receptors are regulated by the availability of GluN subunits within the ER, the presence of ER retention and export signals, and posttranslational modifications including phosphorylation and palmitoylation. However, the role of N-glycosylation in regulating of NMDA receptor processing has not been studied in detail. The aim of this study was to clarify the mechanisms of regulation of surface expression and functional properties of NMDA receptors. We used a combination of molecular biology, microscopy, biochemistry and electrophysiology in heterologous (COS-7 and HEK293 cells) and native (cerebellar granule cells (CGC) and hippocampal cultures) expression systems, which allow us the complex view of the issue. Our results show that surface delivery of GluN1/GluN2C receptors is regulated by three distinct regions within the i) A2 segment of amino-terminal domain (ATD), ii) M3 transmembrane domain and iii) proximal part of C-terminal domain (CTD), including SLPSP motif. iv) We also found that NMDA receptors are released from the ER only when two asparagine residues in the GluN1 subunit (Asn-203 and Asn-368) are N-glycosylated. v) Furthemore, we found that removing N-glycans from native NMDA receptors altered the receptor affinity for glutamate. vi) Our experiments also identified 23 different types of lectins which associate with both GluN1 and GluN2B NMDA receptor subunits and altered their biophysical properties. vii) Finally we found, that 11 out of 12 predicted N-glycosylation sites in GluN1 subunit and 7 out of 7 N-glycosylation sites in GluN2B subunit are occupied by N-glycans. Key words: glutamate receptor; cerebellar granule cells; HEK293 cells; ion channel; intracellular trafficking; endoplasmic reticulum; N-glycosylation; biochemistry; electrophysiology
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Katarína Lichnerová 6.9 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Katarína Lichnerová 17.62 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Katarína Lichnerová 52 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Katarína Lichnerová 84 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc. 151 kB