velikost textu

Pathobiochemistry of lysosomal storage disorders: Study of Fabry disease and generation of cellular models of X-linked disorders.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Pathobiochemistry of lysosomal storage disorders: Study of Fabry disease and generation of cellular models of X-linked disorders.
Název v češtině:
Patobiochemie lysosomálních střádavých onemocnění: studie Fabryho nemoci a příprava buněčných modelů X-vázaných chorob.
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Jitka Rybová
Id práce:
208843
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
28. 11. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Lysosomální střádavá onemocnění, glykosfingolipidy, Fabryho choroba, mukololysacharidosa typu II, indukované pluripotentní kmenové buňky, diferenciace, inaktivace X chromosomu, neurální buňky
Klíčová slova v angličtině:
Lysosomal storage disorders, glycosphingolipids, Fabry disease, mucopolysaccharidosis type II, induced pluripotent stem cells, differentiation, X chromosome inactivation, neural cells
Abstrakt:
Abstrakt Lidské autoptické či bioptické vzorky tkání, myší modely a buněčné kultury různých typů představují nejčastější materiál při zkoumání buněčné patogeneze dědičných chorob. Tato dizertační práce je věnována všem uvedeným přístupům při studiu dvou X-vázaných lysosomálních onemocnění a to Fabryho choroby (FD, deficit α-galaktosidasy A, AGAL) a mukopolysacharidosy typu II (MPSII, deficit iduronát-2-sulfatasy, IDS). Prvotním cílem práce byla analýza krevních lipidních B-antigenů s terminální α-galaktózou (B-GSL) v pankreatu pacientů s FD a krevní skupinou B (FD-B). B-GSLs představují vedle hlavního glykosfingolipidu (GSL), globotriaosylceramidu (Gb3Cer) další minoritní substrát AGAL. Deposita nedegradovaných B-GSL byla prokázána v autoptických vzorcích pankreatu FD-B pacientů a byla zde výrazně vyšší než u ostatních orgánů jako ledviny a plíce, kde se primárně ukládá Gb3Cer. Vysoká koncentrace lipidních i nelipidních B-antigenů byla u FD-B potvrzena především v exokrinních acinárních epiteliálních buňkách, doprovázená masivní akumulací ceroidu (sekundární znak lysosomálního střádání). Endokrinní část pankreatu zůstala na rozdíl od acinů zcela nepostižena ukládáním substrátů AGAL. Tento zajímavý fenomén buněčné biologie ukazuje, jak může specifická krevní skupina ovlivnit projevy nemoci v orgánech pacientů. Jelikož ledviny představují u FD jeden z nejpostiženějších orgánů, byla v další části práce studována distribuce vybraných GSLs a jejich molekulových typů (isoforem) v řezech ledvin u myšího modelu FD. Pomocí zobrazovací hmotnostní spektrometrie (MSI) bylo identifikováno pět isoforem Gb3Cer zvýšených převážně v kůře ledvin s klesajícím trendem směrem k medule. Zvýšená pozitivita Gb3Cer byla dána zejména depozity v kortikálních tubulech. Tyto výsledky byly v souladu s histochemickými nálezy i s výsledky tandemové hmotnostní spektrometrie, ale MSI ukázala navíc další detaily molekulárního složení nedegradovaného Gb3Cer (i některých dalších lipidů). Využití buněčných kultur získaných od pacientů představuje klasickou cestu studia chorob. Lidské primární kultury však mají omezení nejen v dostupnosti materiálu ale i v nesnadnosti získat buněčné typy relevantní pro chorobu. Tato omezení z velké části odstraňují indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC). Představují nový směr zkoumání buněčné patologie a patobiochemie dědičných chorob v průběhu časného vývoje a platformu pro testování terapeutických intervencí. Našim důležitým cílem proto bylo vytvoření iPSC linií vybraných lysosomálních chorob, které budou sloužit jako základ pro diferenciaci do vybraných, střádáním postižených, buněčných typů. V rámci této práce byly založeny iPSC linie FD (FD-iPSC) a MPSII (MPSII-iPSC). Doposud jsou známy dva stavy iPSC lišící se zejména inaktivací X chromosomu (XCI) v samičích buňkách, označované jako primed (buňky po reprogramování s inaktivací jednoho z chromosomů X) a naïve (odvozené od primed iPSC, s oběma aktivními chromosomy). Změna kultivačního media u FD- iPSC a MPSII-iPSC , vedoucí k přechodu primed iPSC do jejich naïve stavu, vedla ke změně morfologie iPSC kolonií u obou nemocí, ale ke změně poměru XCI pouze u FD-iPSC klonu. Vzhledem k tomu že u MPS II dochází také k postižení CNS, byly připravené MPSII-iPSC linie následně diferencovány do směsi neurálních buněk. Byla potvrzena zvýšená exprese lysosomálních markerů převážně v gliových buňkách a přítomnost abnormálních struktur bez ohraničující membrány. Akumulace glykosaminoglykanů (GAG) byla potvrzena ve směsi terminálně diferencovaných pacientských neurálních buněk. Přídavek rekombinantní IDS v kultivačním mediu měl pouze mírný preventivní efekt. Přetrvávající akumulace GAG je pravděpodobně dána jejich přítomností na plasmatické membráně, kde nemohou být degradovány rekombinantní IDS plně aktivované jen v kyselém prostředí lysosomů. FD-iPSC linie byly diferencovány do spontánně bijících klastrů kardiomyocytů (CM). Důvodem k jejich přípravě jsou časté kardiomyopatie u pacientů s FD. U FD-CM byla detekována zvýšená koncentrace Gb3Cer i méně početná a dezorganizovaná fibrilární vlákna. Úspěšná internalizace komerčně dostupné rekombinantní AGAL byla potvrzena kolokalizací s lysosomálním markerem Cathepsinem D. Funkční CM budou dále používány k testování terapeutických postupů, např. pomocí farmakologických chaperonů. Dále jsme se zabývali otázkou, zda se na degradaci substrátů AGAL může podílet strukturně příbuzný enzym α-N-acetylgalaktosaminidasa (NAGA), jak upozorňovaly dřívější práce na kožních fibroblastech u FD. Naše metabolické experimenty s radioaktivními substráty na lidských buněčných iPSC modelech s vyřazeným genem pro AGAL, NAGA i obou genů zároveň, však spíše naznačují přítomnost jiné α-galaktosidasy účastnící se degradace B-GSL.
Abstract v angličtině:
Abstract Human autopsy or biopsy tissue samples, mouse models and cell cultures of various types represent the most common materials in the investigation of cell pathogenesis of inherited diseases. This dissertation is devoted to all these approaches in the study of two X-linked lysosomal storage diseases, Fabry disease (FD,α-galactosidase A (AGAL) deficiency) and mucopolysaccharidosis type II (MPSII, idunorate-2- sulfatase (IDS) deficiency). The primary goal of the work was analysis of lipid blood group B antigens with terminal α-galactose (B-GSL) in the pancreas of FD patients with blood group B (FD-B).,In addition to the main glycosphingolipid (GSL) substrate, globotriaosylceramide (Gb3Cer), B-GSLs represent another minor substrate of AGAL. The deposition of undegraded B-GSL has been demonstrated in FD-B pancreas where it was significantly higher than in other organs such as the kidneys and lungs which accumulate mainly Gb3Cer. High concentration of lipid and non-lipid B-antigens was primarily confirmed in exocrine acinar epithelial cells of FD-B, accompanied by massive accumulation of ceroid (secondary sign of lysosomal storage). Unlike acini, the endocrine portion of the pancreas remained unaffected by accumulation of AGAL substrates. This interesting phenomenon of cell biology shows how a specific blood group can influence organ manifestations in patients. Since the kidneys represent the most affected organ in FD, distribution of selected GSLs and their molecular types (isoforms) was examined in the tissue sections of FD mouse model in the next part of this work. Five increased isoforms of Gb3Cer was identified in renal cortex by mass spectrometry imaging with declining trend towards medulla. Increased positivity of Gb3Cer was mainly due to storage in cortical tubules. These results were consistent with both histochemical findings and tandem mass spectrometry but the MSI showed extra details of molecular composition of undegraded Gb3Cer (or other lipids). The use of cell cultures derived from patients is the classic pathway for the study of disease phenotype. Human primary cultures, however, have limitations not only in material availability but also in difficulty to obtain cell types relevant to disease. Induced pluripotent stem cells (iPSC) remove a large part of these limitations. They represent a new direction for exploring cellular pathology and pathobiochemistry of inherited diseases during early development and a platform to test therapeutic interventions. Therefore, our important goal was to generate iPSC lines for selected lysosomal diseases that will serve as a basis for differentiation into selected cell types affected by storage. In this work, the iPSC lines of FD (FD-iPSC) and MPSII (MPSII-iPSC) were established. Two states of iPSCs have been identified so far, varying mainly by X chromosome inactivation (XCI) in female cells, referred to as primed (cells after reprogramming with inactivation of one of the X chromosomes) and naïve (derived from the primed cells with both X-chromosomes active). Change of culture media of FD-iPSC and MPSII-iPSC leading to the transition of primed iPSC to their naïve state, led to the change in the morphology of the iPSC colonies in both diseases, but the change in the XCI ratio was recorded in the FD-iPSC clone, only. Since MPS II also affects the CNS, the generated MPSII- iPSC lines were subsequently differentiated into a mixture of neural cells. Increased expression of lysosomal markers and presence of abnormal structures without limiting membrane were largely proven in glial cells. Glycosaminoglycan (GAG) accumulation was confirmed in a mixture of terminally differentiated patient’s neural cells. Addition of recombinant IDS to the culture medium had only a mild preventative effect. The persistence of GAG accumulation is probably due to their increased incidence on the plasma membrane, where they cannot be degraded by recombinant IDS fully activated only in acidic environment of lysosomes. FD-iPSC lines were differentiated into spontaneously beating clusters of cardiomyocytes (CM). The reason of their preparation are frequent cardiomyopathies in FD patients. Increased concentration of Gb3Cer, less numerous and disorganized fibers were detected in FD-CM. Effective internalization of commercially available recombinant AGAL was confirmed by co-localization with lysosomal marker Cathepsin D. Functional CM will be further used for testing of therapeutic approaches, e.g., by pharmacological chaperones. We have further addressed the question of whether a structurally related enzyme α-N-acetylgalactosaminidase (NAGA) can participate on the degradation of AGAL substrates as suggested by earlier work on dermal fibroblasts in the FD. Our metabolic experiments with radiolabeled AGAL substrates in iPSC based lines with knocked-out genes for AGAL, NAGA or both enzymes, rather indicate the presence of another α-galactosidase involved in B-GSL degradation.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jitka Rybová 37.76 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Jitka Rybová 225 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jitka Rybová 214 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jitka Rybová 133 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Gustav Entlicher, CSc. 152 kB