velikost textu

Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Bakteriální RTX proteiny a jejich vazebná místa pro vápník.
Název v angličtině:
Bacterial RTX toxins and their calcium-binding sites
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Petra Matyska Lišková
Id práce:
207906
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Mikrobiologie (NMIKRO)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
16. 11. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
RTX protein, vazebná místa pro vápník, fluorescence
Klíčová slova v angličtině:
RTX protein, calcium-binding site, fluorescence
Abstrakt:
Abstrakt Protein FrpC je produkovaný bakterií Neisseria meningitidis v lidském hostiteli. Tento protein je charakteristický přítomností RTX domény, která jej řadí do stejnojmenné rodiny bakteriálních toxinů. Protein FrpC vykazuje unikátní autokatalytickou štěpící aktivitu, kterou zajišťuje 177 aminokyselin dlouhá část (SPM, Self-Processing Module). Bez navázaného Ca2+ zaujímá SPM neuspořádanou strukturu. Po vazbě iontu se protein sbalí a je schopen vykonat enzymatickou aktivitu. Analýza struktury sbaleného SPM by mohla odhalit funkční souvislosti vazby iontu a autokatalytického sestřihu. Bohužel řešení struktury SPM pomocí NMR se ukázalo být velmi obtížné kvůli dlouhé nestrukturované části sekvence uvnitř SPM. Předmětem této práce se tedy stal popis SPM pomocí fluorescenčních metod, charakterizace vazby iontu do SPM, tak i strukturních změn, které se v průběhu vazby Ca2+ odehrávají. Byla stanovena disociační konstanta vazby kovového iontu do SPM, kD~17 µM, která se nachází v koncentračním rozmezí Ca2+, kdy dochází ke sbalování SPM proteinu (1-20 µM). Součástí pochopení struktury SPM bylo zjištění, že obě tryptofanová rezidua Trp451 a Trp519 v SPM interagují jak s navázanými ionty, tak spolu navzájem. Pro tento účel byly použity plně funkční varianty SPM s jedním tryptofanem, W451F a W519F, a luminiscenční analog vápníku, terbium (Tb3+). Měřením rezonančního přenosu energie (FRET) z Trp na Tb3+ byla určena vzdálenost 6 Å, která ve sbaleném SPM proteinu dělí Trp451 a navázaný iont Tb3+. Součástí této práce je také metodický náhled do vlastností Tb3+, jehož absorpční vlastnosti jsou proměnné podle toho, je-li navázáno v hydrofobním vazebném místě, či volně v roztoku. Pochopení vlivu elektrostatické interakce mezi dvěma tryptofany na terciární strukturu proteinů pomocí geometrických analýz dostupných konfigurací Trp-Trp z proteinových struktur z PDB databáze umožnilo odůvodněně navrhnout konfiguraci Trp-Trp v rámci SPM. Klíčová slova: auto-katalytické štěpení, RTX proteiny, FrpC protein, vazebné místo pro vápník, vápník, terbium, Neisseria meningitidis
Abstract v angličtině:
Abstract FrpC protein produced by Neisseria meningitidis in a human host belongs to the family of bacterial RTX toxins due to the presence of RTX domain. FrpC possesses a calcium-dependent auto-catalytic cleavage activity which is localized within its 177 amino-acids long segment Self-Processing Module (SPM). As the SPM is naturally intrinsically disordered protein without bound Ca2+, the calcium binding is crucial for SPM folding which is followed by the auto-catalytic processing. The elucidation of the SPM structure may be the key step for understanding of enzymatic and biological function. The structure of folded SPM itself can be characterized only with difficulties due to the presence of flexible loop according to preliminary NMR data. The subject of this work is the description of SPM using fluorescence methods, characterization of ions binding to SPM and structural changes occurring during Ca2+ binding. In this work, the ion binding properties of SPM segment and its ion-induced folding was characterized. It was found that the dissociation constant kD of 17 μM coincided with the folding of SPM into the native calcium-bound state which occurs in the concentration range between 1 and 20 μM Ca2+. In the attempt to characterize the structure of ion binding site, the fully active single tryptophan mutants W451F and W519F together with Tb 3+, a luminescent analog of Ca2+, were used. Due to the FRET between tryptophan and Tb3+ as donor and acceptor, respectively, the determination of the 6 Å distance between bound Tb3+ and 451W tryptophan residue of SPM was possible. The other part of this work is also a methodical insight to the properties of Tb3+ ion usage, whose absorption properties vary while bound in a hydrophobic binding site or located in the solvent. Understanding the influence of electrostatic interactions between two tryptophan in the tertiary structure of proteins by geometric analysis of the possible Trp-Trp configurations from the protein structures from the PDB database enables to discover the most probable Trp-Trp configurations within the SPM protein. Keywords: auto-catalytic cleavage, RTX protein, FrpC protein, calcium-binding sites, calcium, terbium, Neisseria meningitidis
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Petra Matyska Lišková 16.11 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Petra Matyska Lišková 90.78 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Petra Matyska Lišková 85 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Petra Matyska Lišková 69 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 151 kB