text size

Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie
Titile (in english):
The detection of protein covalent complexes with DNA using fluorescent microscopy
Type:
Diploma thesis
Author:
Mgr. Růžena Melicharová
Supervisor:
Mgr. Anna Jirkovská, Ph.D.
Opponent:
Mgr. Eva Novotná, Ph.D.
Consultant:
Mgr. Veronika Skalická
Thesis Id:
206372
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Biochemical Sciences (16-16160)
Study programm:
Pharmacy (M5206)
Study branch:
Pharmacy (FAR)
Degree granted:
Mgr.
Defence date:
05/06/2020
Defence result:
Excellent
Language:
Czech
Keywords (in czech):
kovalentní komplexy DNA-protein, imunofluorescence, TARDIS
Keywords:
DNA-protein covalent complexes, immunofluorescence, TARDIS
Abstract (in czech):
ABSTRAKT Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Růžena Melicharová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie Antracyklinová antibiotika patří mezi nejúčinnější protinádorová léčiva. Jejich mechanismus účinku je komplexní. Působí jako interkalační činidla, způsobují vznik DNA aduktů a působí na topoisomerasu (TopII) jako jedy. Katalytický cyklus TopII je přerušen ve chvíli, kdy antracykliny stabilizují kovalentní komplex DNA a TopII, a tím způsobují buněčné poškození. Použití antracyklinů je však limitováno několika závažnými nežádoucími účinky, jako je myelotoxicita či kardiotoxicita. Mechanismus kardiotoxicity stále není jasný, ale mohl by být spojený s působením na TopIIβ isoformu. TopIIβ je na rozdíl od TopIIα přítomna v buňkách diferencovaných, jako jsou kardiomyocyty. Navíc jediný klinicky používaný kardioprotektant dexrazoxan patří mezi TopII katalytické inhibitory. Nicméně detaily protektivního působení zajištěného dexrazoxanem jsou nejasné. Cílém této práce bylo optimalizovat metodu TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) k detekci a kvantifikaci kovalentních komplexů, porovnat různé způsoby analýzy počtu komplexů a vybrat vhodnou statistickou metodu. Pro pokusy byly použity buňky lidské leukemické linie HL-60 a primární neonatální ventrikulární kardiomyocyty (NVCM). Po inkubaci s vybranými látkami byly buňky zachyceny v agaróze a lyzovány. Následně byly komplexy označeny primární protilátkou proti TopIIβ a sekundární protilátkou konjugovanou s fluorescenční sondou Alexa Fluor. Získaný signál byl analyzován programem Cell Profiler. Použitím optimalizované metody jsme testovali schopnost různých TopII inhibitorů (etoposid, daunorubicin, XK- 469, dexrazoxan a BNS-22) stabilizovat kovalentní komplexy, nebo zabránit jejich vzniku.
Abstract:
ABSTRACT Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department od Biochemical Sciences Candidate: Růžena Melicharová Supervisor: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Title of thesis: The detection of protein covalent complexes with DNA using fluorescent microscopy Anthracycline antibiotics are present one of the most potent antineoplastic drugs. The mechanism of their action is complex. They are reported to intercalate to DNA, form DNA adducts and interact with topoisomerase II (TopII) as its poisons. Catalytic cycle of TopII is interrupted when anthracyclines stabilize the covalent complex of DNA and TopII and that causes cell damage. However, using of anthracyclines is limited by several adverse effects e. g. myelotoxicity and cardiotoxicity. The mechanism of cardiotoxicity is still unclear but may be associated with poisoning of the TopIIβ isoform. Unlike the TopIIα, TopIIβ is present mostly in quiescent cells as cardiomyocytes. Furthermore, the only clinically approved cardioprotective drug dexrazoxane belongs to TopII catalytic inhibitors. Nevertheless, the details of the dexrazoxane-afforded protection are unclear. This thesis was aimed to optimize the TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) assay to detect and quantify covalent cleavage complexes, compare different ways for analysis of the complexes and finally choose an appropriate type of statistical analysis. For our study human leukemic cell line HL-60 and primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes (NVCM) were used. After incubation with the selected drug, the cells were „trapped“ in agarose and lysed. Subsequently the complexes were labeled with anti-TopII primary antibody and Alexa Fluor conjugated secondary antibody. The acquired signal was then analysed by Cell Profiler program. Using this optimized method, we tested the ability of various types of TopII inhibitors (etoposide, daunorubicin, XK-469, dexrazoxane and BNS-22) to stabilize cleavage complexes or prevent them, respectively.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Růžena Melicharová 1.5 MB
Download Abstract in czech Mgr. Růžena Melicharová 91 kB
Download Abstract in english Mgr. Růžena Melicharová 92 kB
Download Supervisor's review Mgr. Anna Jirkovská, Ph.D. 124 kB
Download Opponent's review Mgr. Eva Novotná, Ph.D. 101 kB
Download Defence's report Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. 154 kB