velikost textu

Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie
Název v angličtině:
The detection of protein covalent complexes with DNA using fluorescent microscopy
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Růžena Melicharová
Vedoucí:
Mgr. Anna Jirkovská, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Eva Novotná, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Veronika Skalická
Id práce:
206372
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biochemických věd (16-16160)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
5. 6. 2020
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
kovalentní komplexy DNA-protein, imunofluorescence, TARDIS
Klíčová slova v angličtině:
DNA-protein covalent complexes, immunofluorescence, TARDIS
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra Biochemických věd Kandidát: Růžena Melicharová Školitel: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Název diplomové práce: Detekce kovalentních komplexů proteinů s DNA s použitím fluorescenční mikroskopie Antracyklinová antibiotika patří mezi nejúčinnější protinádorová léčiva. Jejich mechanismus účinku je komplexní. Působí jako interkalační činidla, způsobují vznik DNA aduktů a působí na topoisomerasu (TopII) jako jedy. Katalytický cyklus TopII je přerušen ve chvíli, kdy antracykliny stabilizují kovalentní komplex DNA a TopII, a tím způsobují buněčné poškození. Použití antracyklinů je však limitováno několika závažnými nežádoucími účinky, jako je myelotoxicita či kardiotoxicita. Mechanismus kardiotoxicity stále není jasný, ale mohl by být spojený s působením na TopIIβ isoformu. TopIIβ je na rozdíl od TopIIα přítomna v buňkách diferencovaných, jako jsou kardiomyocyty. Navíc jediný klinicky používaný kardioprotektant dexrazoxan patří mezi TopII katalytické inhibitory. Nicméně detaily protektivního působení zajištěného dexrazoxanem jsou nejasné. Cílém této práce bylo optimalizovat metodu TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) k detekci a kvantifikaci kovalentních komplexů, porovnat různé způsoby analýzy počtu komplexů a vybrat vhodnou statistickou metodu. Pro pokusy byly použity buňky lidské leukemické linie HL-60 a primární neonatální ventrikulární kardiomyocyty (NVCM). Po inkubaci s vybranými látkami byly buňky zachyceny v agaróze a lyzovány. Následně byly komplexy označeny primární protilátkou proti TopIIβ a sekundární protilátkou konjugovanou s fluorescenční sondou Alexa Fluor. Získaný signál byl analyzován programem Cell Profiler. Použitím optimalizované metody jsme testovali schopnost různých TopII inhibitorů (etoposid, daunorubicin, XK- 469, dexrazoxan a BNS-22) stabilizovat kovalentní komplexy, nebo zabránit jejich vzniku.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department od Biochemical Sciences Candidate: Růžena Melicharová Supervisor: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Title of thesis: The detection of protein covalent complexes with DNA using fluorescent microscopy Anthracycline antibiotics are present one of the most potent antineoplastic drugs. The mechanism of their action is complex. They are reported to intercalate to DNA, form DNA adducts and interact with topoisomerase II (TopII) as its poisons. Catalytic cycle of TopII is interrupted when anthracyclines stabilize the covalent complex of DNA and TopII and that causes cell damage. However, using of anthracyclines is limited by several adverse effects e. g. myelotoxicity and cardiotoxicity. The mechanism of cardiotoxicity is still unclear but may be associated with poisoning of the TopIIβ isoform. Unlike the TopIIα, TopIIβ is present mostly in quiescent cells as cardiomyocytes. Furthermore, the only clinically approved cardioprotective drug dexrazoxane belongs to TopII catalytic inhibitors. Nevertheless, the details of the dexrazoxane-afforded protection are unclear. This thesis was aimed to optimize the TARDIS (trapped in agarose DNA immunostaining) assay to detect and quantify covalent cleavage complexes, compare different ways for analysis of the complexes and finally choose an appropriate type of statistical analysis. For our study human leukemic cell line HL-60 and primary rat neonatal ventricular cardiomyocytes (NVCM) were used. After incubation with the selected drug, the cells were „trapped“ in agarose and lysed. Subsequently the complexes were labeled with anti-TopII primary antibody and Alexa Fluor conjugated secondary antibody. The acquired signal was then analysed by Cell Profiler program. Using this optimized method, we tested the ability of various types of TopII inhibitors (etoposide, daunorubicin, XK-469, dexrazoxane and BNS-22) to stabilize cleavage complexes or prevent them, respectively.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Růžena Melicharová 1.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Růžena Melicharová 91 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Růžena Melicharová 92 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Anna Jirkovská, Ph.D. 124 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Eva Novotná, Ph.D. 101 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. 154 kB