text size

Analýza steroidů ze skupiny androgenů a glukokortikoidů pomocí UHPSFC-MS/MS

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Analýza steroidů ze skupiny androgenů a glukokortikoidů pomocí UHPSFC-MS/MS
Titile (in english):
Analysis of steroids from the group of angrogens and glucocorticoids using UHPSFC-MS/MS
Type:
Diploma thesis
Author:
Bc. Taťána Gazárková
Supervisor:
Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D.
Opponent:
PharmDr. Petr Chocholouš, Ph.D.
Thesis Id:
205645
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Analytical Chemistry (16-16140)
Study programm:
Healthcare bioanalytics (N5207)
Study branch:
Specialist in Laboratory Methods (OPLM)
Degree granted:
Mgr.
Defence date:
03/06/2020
Defence result:
Excellent
Language:
Czech
Abstract (in czech):
ABSTRAKT Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Taťána Gazárková Školitel: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Název diplomové práce: Analýza steroidů ze skupiny androgenů a glukokortikoidů pomocí UHPSFC-MS/MS Cílem této práce bylo vyvinout a optimalizovat metodu pro separaci směsi 37 steroidů pomocí ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie s hmotnostní detekcí (UHPSFC–MS/MS). Analýzy probíhaly s využitím systému Acquity UPC2 s hmotnostním detektorem typu trojitého kvadrupólu Xevo TQ-XS firmy Waters. V prvním kroku byla nezbytná důsledná charakterizace prekurzorů jednotlivých analyzovaných látek s následným provedením Skenu produktových iontů a výběru vhodných SRM přechodů. Steroidy jsou izomerní a vzájemně izobarické látky poskytující často stejné prekurzorové ionty ([M+H]+, [M+H-H2O]+, případně [M+H-2H2O]+) nebo obdobná fragmentační spektra. To je komplikováno skutečností, že ne vždy je nejintenzivnějším iontem spektra právě [M+H]+, ale třeba i [M+H-H2O]+ iont, který je zároveň izobarickou m/z pro úplně jinou látku. Po pečlivém výběru SRM přechodů byla dále provedena optimalizace podmínek iontového zdroje pro pozitivní i negativní mód. V dalším kroku byl proveden screening 18 stacionárních fází. Gradientová eluce využívala CO2 (složka A) s 5 – 40 % MeOH + 0,1% NH4OH (složka B) v průběhu 5 minut s následným izokratickým krokem při 40 % složky B po dobu 1 minuty. Podmínky separace byly nastaveny následovně: teplota 40 °C, průtok 1,5 ml/min, tlak 150 bar. V rámci screeningu bylo nejlepší separace dosaženo na kolonách Torus 1-AA a GreenSep Naphthyl HC, jejichž podmínky separace byly dále optimalizovány. Bylo testováno 5 mobilních fází s odlišnou eluční sílou (MeOH, MeOH:ACN 1:1, EtOH, IPA, IPA:ACN 1:1) za různých podmínek gradientové eluce s variovanou délkou analýzy. Dále byla optimalizována teplota kolony v rozmezí 22 – 50 °C a testován vliv gradientových křivek 2, 4, 6, 8 a 10. Nejlepší selektivity separace bylo dosaženo na koloně Torus 1-AA (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) při použití MeOH (složka B) v lineárním gradientu 1 až 20 % složky B, v délce analýzy 13 minut a následnou 2minutovou ekvilibrací kolony, při teplotě 22 °C. Klíčová slova: androgeny; glukokortikoidy; steroidy; UHPSFC-MS/MS; vývoj metody; optimalizace Poděkování: Tato práce vznikla za podpory projektu STARSS reg. č.: CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000465 spolufinancovaného z EFRR.
Abstract:
ABSTRACT Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Taťána Gazárková Supervisor: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Title of Diploma Thesis: Analysis of steroids from the group of androgens and glucocorticoids using UHPSFC-MS/MS The goal of this study was to develop and optimize an analytical method for the separation of 37 steroids mixture by the ultra–high performance supercritical fluid chromatography hyphenated to mass spectrometry (UHPSFC–MS/MS). Analysis was carried out using Waters Acquity UPC2 system coupled to Xevo TQ-XS mass spectrometer. In the first step it was necessary to consistently characterize the precursor ions of each analyte. Then, the Product ion scan was carried out and proper SRM transitions were chosen. Steroids are isomeric and isobaric substances that often provide the same precursor ions ([M+H]+, [M+H-H2O]+, eventually [M+H-2H2O]+), or similar fragmentation spectra. This is complicated by the fact that most intense ion of the spectrum is not always [M+H]+, but also [M+H-H2O]+ ion which is simultanously isobaric m/z for a completely differnt compoud. After careful selection of SRM transitions, the conditions of the ion source were optimized for both positive and negative modes. In the next step, the screening of 18 stationary phases was carried out. The gradient elution involved CO2 (solvent A) and 5 – 40 % MeOH + 0.1% NH4OH (solvent B) in 5 minutes with isocratic step hold for 1 minute at 40 % of solvent B. The chromatographic conditions were set as follows: temperature 40 °C, flow-rate 1.5 mL/min and ABPR pressure 150 bar. The most successful separation was obtained with Torus 1-AA and GreenSep Naphthyl HC columns, that become subject of following optimization. According to different elution strength, the 5 mobile phases (MeOH, MeOH:ACN 1:1, EtOH, IPA, IPA:ACN 1:1) were tested in several gradient conditions, with various time of analysis. Further, the temperature optimization was carried out in the range 22 – 50 °C and the effect of gradient curves 2, 4, 6, 8 and 10 was measured. The best selectivity of separation was achieved using the Torus 1-AA (100 x 3.0 mm, 1.7 µm) with CO2 and MeOH (solvent B) in the linear gradient elution from 1 to 20 % of solvent B in 13 minutes, and 2 minutes of equilibration in combination with the temperature of analysis 22 °C. Keywords: androgens; glucocorticoids; steroids; UHPSFC-MS/MS; method development; optimization Acknowledgements: This work was supported by the STARSS project (Reg. No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000465) co-funded by ERDF.
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Bc. Taťána Gazárková 9.31 MB
Download Attachment to the thesis Bc. Taťána Gazárková 226 kB
Download Abstract in czech Bc. Taťána Gazárková 152 kB
Download Abstract in english Bc. Taťána Gazárková 136 kB
Download Supervisor's review Doc. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. 122 kB
Download Opponent's review PharmDr. Petr Chocholouš, Ph.D. 130 kB
Download Defence's report Prof. RNDr. Petr Solich, CSc. 153 kB