velikost textu

Možnosti a význam dlouhodobé kultivace embryonálních buněk různých živočišných druhů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Možnosti a význam dlouhodobé kultivace embryonálních buněk různých živočišných druhů
Název v angličtině:
Abilities and importance long-term cultivation embryonic cells from different species of animals
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Zbyněk Houdek, Ph.D.
Id práce:
204133
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Fyziologie živočichů (NFYZZIV)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
21. 9. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Embryonální buňky uvnitř blastocysty, které se dále dělí a diferencují v buňky všech tkání organismu se nazývají embryonální kmenové (ES) buňky. Využití lidských ES buněk formou transplantací je jednou z možných cest regenerativní medicíny. Předložená práce zahrnuje studium 2 různých linií myších pluripotentních buněk - embryonálních karcinomových buněk (EC) P19 a ES buněk linie D3. Buňky jsme kultivovali v základním kultivačním médiu s fetálním bovinním sérem (FBS) a navíc u ES buněk s leukemickým inhibičním faktorem (LIF). Tyto složky zajišťují jejich pluripotenci a sebeobnovu. Následovala jejich neurodiferenciace změnou kultivačního média, bez FBS a u ES buněk i bez LIF. Naopak do média byla přidávána k indukci neurodiferenciace retinová kyselina (RA) a u ES buněk byla navíc zařazena kultivace embryoidních tělísek (EBs). Pluripotence a neurodiferenciace buněk byla ověřena molekulárně-biologickými metodami, kterými byly zjištěny u obou linií nediferencovaných buněk markery pluripotence a po jejich neurodiferenciaci přítomnost neuronálních markerů. Následovaly transplantace, při nichž byly myší EC P19 buňky trvale transfekované genem pro zeleně fluoreskující protein (GFP) aplikovány do zdravého mozečku myší typu wild (WT) a postiženého mozečku myší typu Lurcher (Lc). Byly použity nediferencované buňky (P19) a od nich odvozené neuroprogenitory (NPG) a hodnoceno bylo přežívání, morfologie a lokalizace transplantátu. Přežívání obou typů GFP pozitivních transplantátů bylo srovnatelné a nezávislé na typu myši. Přežívání NPG i P19 buněk bylo významně nižší u myší Lc než u myší WT. Destrukce uvnitř transplantátu byly zjištěny pouze v transplantátech s NPG, expanze byla přítomna vždy po aplikaci P19 buněk a méně u NPG. Transplantované buňky nemigrovaly a nešířily se v rámci mozečku. Fenotyp GFP pozitivních transplantovaných buněk byl prokázán imunohistochemicky přítomností neuronálních markerů. Z hlediska lokalizace se transplantát vyskytoval u myší WT převážně v mozečku, ale u myší Lc vždy mimo mozeček s neurodegenerací. LIF jsme se dále věnovali v širším kontextu – význam tohoto cytokinu v časné embryogenezi a tím pádem i v plodnosti je široce zkoumán nejen na buněčných liniích, ale i u lidí. Zkoumali jsme tedy i význam LIF na plodnost žen a věnovali jsme se přímé korelaci mutací v genu pro LIF s jejich plodností. Vyšetřovali jsme mutace v tomto genu jak v populaci infertilních žen, tak v kontrolní populaci zdravých plodných žen. U 15 neplodných žen byla nalezena identická mutace v exonu 3 na pozici 3400 genu pro LIF, která vede při translaci k záměně valinu za methionin v kodónu 64 (V64M), jež je součástí AB kličky LIF proteinu, klíčové oblasti v interakci s receptorem pro LIF. Následně byl zkoumán vliv této mutace na úspěšnost léčby neplodnosti těchto žen ve srovnání se skupinou neplodných žen bez přítomnosti mutace.
Abstract v angličtině:
Embryonic cells inside the blastocyst, which divide and differentiate into cells of all tissues of organism, are called embryonic stem (ES) cells. Using the ES cells for transplantations is one the potential ways in regenerative medicine. The present study deals with two different lines of mouse pluripotent cells: embryonic carcinoma (EC) cells line P19 and ES cells line D3. The in vitro cultivation was performed in basal cultivation medium with fetal bovine serum (FBS) and in addition of leukemia inhibitory factor (LIF) in case of ES cells. The neurodifferentiation was induced by medium without FBS and without LIF in case of ES cells and supported by retinoic acid in case of P19 cells and embryoid bodies cultivation in case of ES cells. Pluripotency and neurodifferentiation of the cells were confirmed by presence of molecular markers of pluripotency and neurodifferentiation in both lines in nondifferentiated and differentiated states. Mouse EC P19 cells were transfected by gene for green fluorescent protein (GFP) and used for transplantation in cerebellum of wild type (WT) and Lurcher (Lc) mutant mice. Nondifferentiated cells (P19) and neuroprogenitors (NPG) derived from these cells were used. The study followed the survival, morphology and localization of the grafts. The survival of both types of GFP grafts was similar in both types of mouse. Survival of NPG and P19 cells was significantly lower in cerebellum of Lc than WT mice. Destructions of grafts were found only in NPG grafts; expansions were more frequent in grafts with P19 cells, than in NPG grafts. The transplanted cells didn’t migrate nor spread into cerebellum. The phenotype of GFP transplanted cells was confirmed by presence of neuronal markers by using immunohistochemistry. Grafts were localized in WT mouse mainly in cerebellum on the contrary to Lc mouse, where they were localized outside the degenerated cerebellum only. Part of the presented study was focused on the characteristic of LIF and its impact on early embryogenesis. This also means its importance for fertility which is deeply investigated also in humans and not only in cell lines. So the part of the study was dedicated to the correlation of the LIF gene status and fertility in women. We investigated the prevalence of the LIF gene mutations in the population of infertile and control healthy fertile women. In fifteen infertile women the potentially functional LIF gene mutation, the G to A transitions at the position 3400 leading to the valin to methionin exchange at codon 64 (V64M) in the AB loop region of the LIF protein, were detected. Finally, the possible impact of this mutation on the infertility treatment outcome was followed.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Zbyněk Houdek, Ph.D. 2.12 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Zbyněk Houdek, Ph.D. 17 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Zbyněk Houdek, Ph.D. 8 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc. 152 kB