velikost textu

Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Umlčování exprese transgenů v rostlinách bramboru a v buněčné linii tabáku BY-2
Název v angličtině:
Transgene silencing in potato plants and tobacco cell line BY-2
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Dimitrij Tyč
Id práce:
202847
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra experimentální biologie rostlin (31-130)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Experimentální biologie rostlin (NEBR)
Přidělovaný titul:
RNDr.
Datum obhajoby:
25. 6. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Náhodný objev RNA interference před pár desítkami let u rostlin a její následné popsání Firem et al. v roce 1998 znamenal doslova revoluci v molekulární biologii a řadě dalších oborů. Výzkumníci odkryli rozsáhlý a nečekaný mechanizmus regulace genové exprese na mnoha úrovních u téměř všech studovaných eukaryot. Prvotní studie u rostlin odhalily umlčování exprese z vnějšku dodaných genů i příslušných endogenů. Brzy bylo tedy jasné, že tento proces neslouží organizmům pouze v obraně před viry, ale i před mobilními genetickými elementy a k regulaci vlastních genů. Společným jmenovatelem všech mechanizmů RNAi je dvouvláknová RNA, která je štěpena na malé RNA. Ty pak řídí v součinnosti s řadou dalších proteinů buď štěpení částečně či plně komplementární mRNA či blokují její translaci v procesu posttranskripčního umlčování (PTGS), nebo se v procesu RNA řízené metylace DNA (RdDM) podílejí na umlčování genů na transkripční úrovni doprovázené remodelací chromatinu. Mechanizmy RNAi se uplatňují i při transformaci rostlin, kdy způsobují v odvozených liniích značnou variabilitu a nestabilitu v expresi vnesených genů. Řada biotechnologických postupů ovšem vyžaduje dlouhodobou definovanou a stabilní expresi transgenu, kterou právě RNAi znesnadňuje. Hlavním cílem diplomové práce bylo posoudit vliv vybraných faktorů na míru umlčování exprese transgenů a nalézt takové podmínky či ošetření, při nichž by docházelo k rychlému umlčení exprese transgenu u linií, které jsou k umlčení náchylné. To by umožnilo ihned po transformaci selektovat linie stabilní v expresi transgenu, resp. linie se sníženým rizikem pozdějšího umlčení transgenu, což je velmi žádoucí jak pro základní tak i aplikovaný výzkum. Prostředkem k tomuto výzkumu byly transgenní linie brambor s umlčenou či obnovenou expresí GFP, linie dlouhodobě stabilně exprimující GFP a tabáková buněčná linie BY-2, která byla v rámci práce transformována nově připravenými konstrukty. V diplomové práci se podařilo pomocí připravených expresních konstruktů prokázat vliv jak kódující sekvence transgenu, tak i vystavení stresovým podmínkám na míru umlčování vnesených genů. Přechod rostlin brambor přes stádium hlízy nevyvolal žádné změny v expresi transgenu. Reaktivace exprese z umlčené jednokopiové transgenní linie bramboru se podařila jen v případě NPTII genu, v případě GFP bylo prokázáno pouze dočasné obnovení exprese. Klíčová slova: RNA intereference, PTGS (posttranskripční umlčování), TGS (transkripční umlčování), tabáková buněčná linie BY-2, lilek brambor, RdDM (metylace DNA řízená malými RNA), GFP, umlčování transgenů
Abstract v angličtině:
Abstract Accidental discovery of RNA interference in plants a few decades ago and its description by Fire et al. (1998) brought a real revolution in molecular biology and in many other branches of biology. Researchers have uncovered a large and unexpected mechanism of regulation of gene expression at many levels in almost all studied eukaryotes. The first studies have revealed silencing of both exogenous and endogenous genes in plants. So, it soon became clear that this process serves to organisms not only in the defense against viruses, but also against mobile genetic elements as well as in modulation of expression own genes. The key role in all RNAi mechanisms is played by dsRNA that is processed into small RNAs. In association with a number of other proteins, small RNAs can direct either cleavage of complementary or nearly complementary mRNAs or block their translation in the process of posttranscriptional gene silencing (PTGS). Additionaly, sRNAs can affect gene expression at transcriptional level via modifying DNA in a process called RNA dependent DNA methylation (RdDM). In plant transformation, RNAi cause variability amongst transgene lines and instability in the expression of introduced genes, which complicates the use of transgenic lines, because many biotechnological approaches require a defined stable transgene expression. The main aim of the thesis was to evaluate the impact of selected factors on the degree of silencing of transgene expression and to find such conditions or treatments, which would cause rapid silencing of the transgene expression in lines that are prone to silence. This would select immediately after transformation the lines with stabile transgene expression, which is very desirable for both basic and applied research. The materials for this research were transgenic potato lines with silenced, restored GFP and long-term stable GFP expression and tobacco cell line BY-2, which was transformed with newly prepared constructs. In the frame of the master thesis, the impact of the transgene coding sequence on silencing was proven by comparing the GFP fluorescence in BY-2 lines transformed with prepared constructs. The rate of transgene silencing was also affected by exposure to stress conditions during potato de novo regeneration. The transition of potato plants through the dormant tuber stage did not reveal any changes in the expression of the transgene. Reactivation of expression from silenced transgenic single-copy line of potato was successful only for the NPTII gene. Only temporary restoration of expression was seen in the case of GFP. Keywords: RNA interference, PTGS (posttranscriptional gene silencing), TGS (transcriptional gene silencing), tobacco BY-2 cell line, Solanum tuberosum, RdDM (RNA- directed DNA methylation), GFP, transgene silencing
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Dimitrij Tyč 3.88 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Dimitrij Tyč 12 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Dimitrij Tyč 8 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D. 152 kB