velikost textu

Vliv proteinu HBx viru hepatitidy B na aktivaci MEK1/2-ERK signalizace a inhibici IFN typu I v hepatocelulární linii Huh7

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vliv proteinu HBx viru hepatitidy B na aktivaci MEK1/2-ERK signalizace a inhibici IFN typu I v hepatocelulární linii Huh7
Název v angličtině:
Effect of HBV protein HBx on activation of MEK1/2 signaling and inhibition of type I IFN in hepatoma cell line Huh7
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Mgr. Olena Berehovska
Vedoucí:
RNDr. Ivan Hirsch, CSc.
Oponent:
Aleš Zábranský, PhD
Id práce:
197803
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
5. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Velmi dobře
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
HBV; potlačení virové replikace; restrikční faktory; virový únik; Toll-like receptory (TLR); regulační immunoreceptory; buněčná signalizace; interferon (IFN); proteinkinázy a jejic inhibitory
Klíčová slova v angličtině:
HBV; suppression of virus replication; restriction factors; virus escape; Toll-like receptors (TLR); regulatory immunoreceptors; cell signaling; interferon (IFN); proteinkinases and their inhibitors
Abstrakt:
Abstrakt Infekce virem hepatitidy B (HBV) je jednou z hlavních příčin chronického a nádorového onemocnění jater. Eliminace HBV z chronicky infikovaných pacientů monoterapií založené na rekombinantním interferonu α (IFNα) ukazuje, že mechanizmy přirozené imunity hrají důležitou roli při potlačení virové infekce. Mechanismy rozpoznávání genomu HBV a jeho úniku před mechanismy přirozené imunity jsou však stále málo známy. Jedním z principiálních faktorů umožňujících viru uniknout před buněčnými restrikčními mechanizmy je virový protein HBx. HBx je pleiotropní multifunkční protein složený ze 154 aminokyselin ovlivňující transkripci, přenos signálu, buněčný cyklus, degradaci proteinů, apoptózu a chromozomální stabilitu v hostitelské buňce. Předchozí výsledky z naší laboratoře ukázaly, že aktivace signální dráhy MEK1/2-ERK v plasmacytoidních dendritických buňkách vede k inhibici produkce IFNα. Cílem mojí práce bylo zjistit, zdali HBx aktivuje dráhu MEK1/2-ERK a inhibuje tím produkci IFN typu I rovněž v hepatocytech. K tomu účelu jsem sledovala tvorbu HBx v hepatomové linii Huh7 pomocí transfekce bicistronického plasmidu pHBx-IRES-EGFP a metody Western blot. Stejnou metodou jsem sledovala aktivaci signální dráhy MEK1/2-ERK pomocí fosforylace kinázy ERK. Moje výsledky ukazují, že maximum exprese HBx v buňkách Huh7 bylo dosaženo 1 den po transfekci pHBx-IRES-EGFP. Densitometrická analýza Western blotu ukázala, že fosforylace kinázy ERK dosáhla přibližně 5 krát vyšších hodnot po transfekci plasmidem pHBx-IRES-EGFP nesoucím divokou alelu HBx než po transfekci plasmidem nesoucím mutantní alelu HBxR96E nebo prázdným vektorem. Transfekce pHBx-IRES-EGFP vede k aktivaci MEK1/2 kinázovou kaskády, kterou bylo možné blokovat inhibitorem kinázy MEK1/2 PD0325901. Tvorbu IFN typu I a jeho inhibici jsem sledovala indukcí exprese IFNβ pomocí poly I:C reakcí RT-PCR. Kvantitativní PCR ukázala, že transfekce pHBx-IRES- EGFP inhibovala přibližně 5 krát expresi IFNβ. Obdržené výsledky potvrzují stimulaci exprese IFNβ působením poly I:C a také inhibiční účinek HBx na tuto stimulaci ve stabilní linii lidských hepatocytů Huh7. Klíčová slova: HBV; potlačení virové replikace; restrikční faktory; virový únik; Toll-like receptory (TLR); regulační immunoreceptory; buněčná signalizace; interferon (IFN); proteinkinázy a jejic inhibitory
Abstract v angličtině:
Abstract Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the major causes of chronic and cancerous liver disease. Elimination of HBV from chronically infected patients by recombinant interferon α (IFNα) monotherapy shows that the mechanisms of the innate immunity play an important role in suppressing viral infection. However, the mechanisms of recognition of the HBV genome and its escape from the mechanisms of natural immunity are still little known. One of the principal factors enabling the virus to escape from cellular restriction mechanisms is the HBx viral protein. HBx is a 154 amino acid pleiotropic multifunctional protein affecting transcription, signal transduction, cell cycle, protein degradation, apoptosis, and chromosomal stability in the host cell. Previous results from our laboratory have shown that activation of the MEK1/2-ERK signaling pathway in plasmacytoid dendritic cells leads to inhibition of IFNα production. The aim of my work was to determine whether HBx activates the MEK1/2-ERK pathway and thus inhibits IFN type I production also in hepatocytes. For this purpose, I monitored HBx production in the Huh7 hepatoma cell line by transfecting the bicistronic plasmid pHBx- IRES-EGFP and Western blotting. Using the same method, I monitored activation of the MEK1/2-ERK signaling pathway by ERK kinase phosphorylation. My results show that maximum expression of HBx in Huh7 cells was reached 1 day after transfection of pHBx- IRES-EGFP. Western blot densitometric analysis showed that ERK phosphorylation reached approximately 5-fold higher level after transfection with the pHBx-IRES-EGFP plasmid carrying the wild-type HBx allele than after transfection with the plasmid carrying the mutant HBxR96E allele or the empty vector. Transfection of pHBx-IRES-EGFP results in activation of the MEK1/2 kinase cascade, which could be blocked by the MEK1/2 kinase inhibitor PD0325901. Type I IFN production and inhibition was followed by induction of IFNβ expression by polyI:C reaction by RT-PCR. Quantitative PCR showed that transfection of pHBx-IRES-EGFP inhibited IFNβ expression approximately 5 times. The obtained results confirm the stimulation of IFNβ expression by poly I:C as well as the inhibitory effect of HBx on this stimulation in the stable human hepatocyte line Huh7. Key word: HBV; suppression of virus replication; restriction factors; virus escape; Toll-like receptors (TLR); regulatory immunoreceptors; cell signaling; interferon (IFN); proteinkinases and their inhibitors
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Olena Berehovska 2.13 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Olena Berehovska 72 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Olena Berehovska 72 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Ivan Hirsch, CSc. 212 kB
Stáhnout Posudek oponenta Aleš Zábranský, PhD 152 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby RNDr. Dana Holá, Ph.D. 154 kB