velikost textu

Klinická klasifikace sekvenčních variant v nekódujících regulačních oblastech genů predisponujících ke vzniku karcinomu prsu.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Klinická klasifikace sekvenčních variant v nekódujících regulačních oblastech genů predisponujících ke vzniku karcinomu prsu.
Název v angličtině:
Clinical classification of sequence variants in non-coding regulatory regions in breast cancer susceptibility genes.
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Eliška Bubáková
Vedoucí:
Mgr. Jan Ševčík, Ph.D.
Oponent:
MUDr. Pavel Vodička, CSc.
Id práce:
197584
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Buněčná a vývojová biologie (NBUNVYB)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
18. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Velmi dobře
Informace o neveřejnosti:
Zveřejnění práce bylo odloženo do 11.03.2021
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
Hereditární karcinom prsu, regulace exprese, promotor, nekódující oblasti genu, klinická klasifikace
Klíčová slova v angličtině:
Hereditary breast cancer, regulation of expression, promoter, non-coding regions, clinical classification
Abstrakt:
Abstrakt Inaktivace tumor supresorového genu BRCA1 příčinou vysokého celoživotního rizika vzniku karcinomu prsu a dalších malignit. Plošný genetický skríning indikovaných jedinců z vysoce rizikových rodin dovoluje identifikovat množství sekvenčních variant v dosud známých predispozičních genech. Většina nově nalezených variant dosud nemá jasný klinický význam a představuje tak z hlediska diagnostiky závažný problém. Část těchto variant se nachází i v nekódujících regulačních oblastech genů. Součástí procesu klinické klasifikace variant je jejich funkční charakterizace. Cílem této práce bylo vytvořit modelový systém pro funkční charakterizaci variant v nekódujících oblastech a následně ověřit jeho funkčnost. Modelový systém byl založen na cílené genové manipulaci pomocí ko-transfekce CRISPR- Cas9 a donorového konstruktu s částí sekvence genu BRCA1, ve které byly zavedeny analyzované modifikace, do U2 OS buněk. Tyto buňky v sobě mají stabilně vložený DR-GFP systém dovolující stanovit aktivitu homologní rekombinace (HR). Do U2 OS buněk se nakonec podařilo zavést monoalelické modifikace. Tyto modifikace se nacházely v oblasti sekvence Kozakové genu BRCA1. Nejdříve byla pomocí qRT-PCR stanovena exprese na úrovni mRNA BRCA1, která byla u všech buněk s analyzovanými alteracemi stejná. Dále byla stanovena exprese na úrovni proteinu pomocí metody ELISA. Bylo zjištěno, že některé z analyzovaných alterací významně snižují v buňkách modelového systému koncentraci BRCA1 proteinu. Dále byla u stabilních klonů pomocí DR-GFP eseje stanovena aktivita HR, ve které BRCA1 participuje, a lze předpokládat, že snížená aktivita tohoto mechanismu může vyvolávat maligní transformaci. Bylo zjištěno, že aktivita HR pozitivně koreluje s koncentrací proteinu BRCA1 a u variant negativně ovlivňujících expresi na úrovni proteinu je významně snížena. Byla tak ověřena funkčnost modelového systému. Bylo potvrzeno, že snížené množství proteinu BRCA1 má za následek nižší aktivitu HR a že alterace v nekódujících regulačních oblastech genu BRCA1 mohou negativně ovlivňovat biologickou aktivitu produktu genové exprese BRCA1 a přispívat tak k riziku vzniku nádorového onemocnění prsní žlázy.
Abstract v angličtině:
Abstract Inactivation of tumor supressor gene BRCA1 causes a life-long risk of breast carcinoma development. Genetic screenings of indicated individuals from high-risk families help to identify large number of sequence variants in known predisposing genes. Majority of discovered variants doesn’t have clinical significance yet which causes a big problem for diagnostics. Some of these variants are found within regulatory non-coding regions of gene. A part of the clinical classification of variants is their functional characterization. The goal of this thesis was to create a model system for functional characterization of variants in non-coding regions and to verify its function. Model system was based on targeted gene manipulation by co-transfecting CRISPR-Cas9 construct and donor construct that contained a portion of BRCA1 gene sequence with analyzed modifications, into U2 OS cells. The cells have stably integrated DR-GFP system which allows the activity of homologous recombination (HR) to be determined. Monoallelic modifications were induced into U2 OS cells. These modifications were in a Kozak sequence region of BRCA1 gene. Expression level of BRCA1 mRNA was determined by qRT-PCR, which showed the same levels of mRNA in all cells with analyzed alterations. Next, expression level of BRCA1 protein was determined by ELISA method. It showed that some of the analyzed alterations had significantly reduced level of BRCA1 protein. Next the activity of HR was determined by DR-GFP assay. BRCA1 participates in HR, and it’s assumed that the reduced activity of this mechanism might cause a malignant transformation. It was found that the activity of HR positively correlates with the concentration of BRCA1 protein. Variants with negative effect on protein expression had significantly reduced HR. This way the functionality of model system was verified. It was also confirmed that reduced levels of BRCA1 cause a reduced activity of HR and that alterations in non-coding regulatory sequences of BRCA1 gene can negatively affect biological activity of the gene expression product which might contribute to the risk of tumorigenesis in mammary gland.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Eliška Bubáková 2.67 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Eliška Bubáková 114 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Eliška Bubáková 92 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Jan Ševčík, Ph.D. 199 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Pavel Vodička, CSc. 209 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. František Půta, CSc. 154 kB