velikost textu

Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Název v angličtině:
Mutant glycosidases with a high substrate specificity and their analysis
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Pavlína Nekvasilová
Vedoucí:
RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Irena Lichá, CSc.
Konzultant:
doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc.
Id práce:
196063
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Klinická a toxikologická analýza (N1413)
Obor studia:
Klinická a toxikologická analýza (NKATA)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
27. 5. 2019
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
β-N-acetylhexosaminidasa, enzymová syntéza, heterologní exprese,, Pichia pastoris, Talaromyces flavus
Klíčová slova v angličtině:
β-N-acetylhexosaminidase, enzymatic synthesis, heterologous expression, Pichia pastoris, Talaromyces flavus
Abstrakt:
Abstrakt β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
Abstract v angličtině:
Abstract β-N-acetylhexosaminidases (EC 3.2.1.52, GH 20) are retaining exo-glycosidases that in vivo cleavage both β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) or β-N-acetylgalactosamine (GalNAc) residues fom glycostructures. Under suitable reaction conditions, these enzymes are able to synthesize the glycosidic bond in good yields. Substitution of selected amino acid(s) in the emzyme active site by site-directed mutagenesis may change the enzyme's substrate specificity or suppress the hydrolytic activity of the enzyme in favor of synthesis. The present thesis deals with three mutant β-N-acetylhexosaminidases from Talaromyces flavus, in which the amino acid residues responsible for binding to C-4 hydroxyl of the substrate (Arg218, Glu546) were exchanged for amino acids proposed on the basis of molecular modeling. The effect of introduced single point mutations on substrate specificity of prepared enzymes was studied. Mutant β-N-acetylhexosaminidases were heterologously expressed in Pichia pastoris and characterized. Furthermore, transglycosylation reactions with these enzymes were performed. The prepared carbohydrate products were characterized by NMR.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Pavlína Nekvasilová 2.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Pavlína Nekvasilová 63 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Pavlína Nekvasilová 60 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D. 315 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Irena Lichá, CSc. 560 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Zuzana Bosáková, CSc. 153 kB