velikost textu

Analýza protilátkové odpovědi u BK virové infekce

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Analýza protilátkové odpovědi u BK virové infekce
Název v angličtině:
Analysis of antibody response during BK virus infection
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Tereza Tomanová
Vedoucí:
RNDr. Hana Španielová, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Martina Saláková, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Alžběta Sekavová
Id práce:
195398
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
5. 6. 2019
Výsledek obhajoby:
Velmi dobře
Informace o neveřejnosti:
Zveřejnění práce bylo odloženo do 04.06.2021
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
polyomaviry, BK virus, subtypově specifické protilátky, virům podobné částice, pseudoviriony
Klíčová slova v angličtině:
polyomaviruses, BK virus, subtype specific antibodes, virus-like particles, pseudovirions
Abstrakt:
Abstrakt BK virus je lidský polyomavirus s vysokou prevalencí v populaci. Obvykle je pro svého hostitele neškodný, komplikace působí při imunosupresi, často při transplantacích ledvin, jelikož perzistuje v epiteliálních buňkách ledvin. Exis- tují čtyři subtypy BK viru a zdá se, že je důležité identifikovat, na jaký subtyp je dárce a příjemce ledviny pozitivní. Takové určení subtypově specifických pro- tilátek pomocí jednoduchého testu by mohlo pomoci s eliminací komplikací po transplantaci ledvin. Při předchozím výzkumu byl vytvořen návrh ELISA testu, který by mohl sérologicky rozlišit hlavní BK virové subtypy (I a IV), ale jeho vývoj je komplikován tím, že mezi jednotlivými subtypy BK viru a protilátkami dochází ke křížové reaktivitě. Klíčem k úspěchu může být modifikace antigenu používaného pro ELISA test. Proto bylo cílem této diplomové práce zmapovat významná místa kapsidového VP1 proteinu BK viru, konkrétně ve smyčkách EF a DE, která by se mohla podílet na interakci s protilátkami. Toho bylo dosaženo cílenou mutagenezí v genu pro VP1, v oblasti EF smyčky nebo DE smyčky, kde došlo k záměně nukleotidů pro dvě povrchové aminokyseliny, ve kterých se liší sekvence subtypu I a IV. Výsledkem byl gen pro VP1 subtypu IV mutovaný tak, že sekvence v oblasti EF smyčky byla shodná se sekvencí VP1 subtypu I. Stejný postup byl proveden i pro oblast DE smyčky. Takto připravené mutanty byly po- užity pro produkci mutantních pseudovirionů v savčím expresním systému. Byly otestovány dva způsoby izolace pseudovirionů, z nichž nejlepší výsledky přinesla izolace v dvouvrstvém gradientu chloridu cesného, které předchází narušení bu- něk vytřepáváním pomocí tetrachloroethylenu. Mutantní DE pseudoviriony na ELISA testu reagovaly stejně, jako nemutované BKV IV částice. Pseudoviriony s mutací v EF smyčce téměř vůbec nereagovaly s žádnou z testovaných protilátek. Kromě ELISA testu byl otestován ještě hemaglutinačně inhibiční test. Bylo zjiš- těno, že při použití morčecích krvinek o koncentraci 0,5 % a při kyselém pH lze při vyšším ředění hyperimunizovaných králičích sér odlišit reaktivitu protilátek proti subtypu I a IV. Efekt ještě umocňuje inaktivace séra pomocí neuraminidázy nebo pomocí jodistanu draselného s trypsinem. Pro rozlišení reaktivity lidských sér se hemaglutinačně inhibiční test ukázal jako nedostačující. Pro vývoj diagnostického testu a případně návrh antigenu, který by dokázal spolehlivě rozlišit jednotlivé subtypy bude potřeba další testování. I tak tento projekt představuje významný přínos pro další diagnostický vývoj sérologického průkazu subtypů BK viru. Klíčová slova: polyomaviry, BK virus, subtypově specifické protilátky, virům po- dobné částice, pseudoviriony
Abstract v angličtině:
Abstract BK virus is a human polyomavirus which is highly prevalent in the population. The virus is usually not very dangerous to its host, but it may cause complicati- ons in immunosuppressed patients. These complications commonly appear after kidney transplantation because BK virus persists in kidney epithelial cells. There are four subtypes of BK virus and it might be clinically important to screen for the identity of subtypes in matched pairs of donors and recipients of the kidney. This determination of the subtype specific antibodies by simple test could help to manage complications after the surgery. During previous project the ELISA test that could serologically differentiate between two main BK virus subtypes (I and IV) was designed, but its development is complicated by the fact that there is a strong cross-reactivity between the BK virus subtypes and antibodies. The modification of antigen towards better specificity might be required to succeed. Consequently, the main aim of this diploma thesis was to map important spots of major capsid protein VP1 of BK virus, particulary in EF and DE loops, which could participate in binding of antibodies. This aim was addressed by targeted mutagenesis of the gene coding VP1 protein in the region of the respective loop. Nucleotides coding two surface aminoacids which differ between subtype I and IV of BK virus were changed in the EF loop region. We gained gene for VP1 protein of subtype IV which was mutated in the EF loop region in a way that the sequence of the EF loop was identical with the sequence of subtype I. The same process was applied for the DE loop region as well. Mutants prepared this way were produced in form of mutant pseudovirions in mammalian expression system. Two types of isolation protocols for pseudovirions were tested and the best results were obtained using isolation in two-layered gradient of cesium chlo- ride with disruption of cells using tetrachloroethylene before the isolation itself. The mutant DE pseudovirions were reacting the same way as non-mutated BKV IV pseudovirions. Pseudovirions containing mutation in EF loop did not react with any of tested antibodies. Besides ELISA, hemagglutination inhibition test was used. It was found that guinea pig erythrocythes diluted to 0,5% in acidic pH enable us to distinguish subtype specific seroreactivity using rabbit hyperim- munized sera. The effect is even stronger while using neuraminidase or potassium periodate with trypsin for inactivation of the sera. Distinguishing subtype specific seroreactivity was insufficient in human sera. More experiments are surely nee- ded for developing diagnostic test or an antigen that could distinguish between particular subtypes. Still, this project represents a meaningful contribution for further development of BK virus subtype specific serological diagnostics. Key words: polyomaviruses, BK virus, subtype specific antibodies, virus-like par- ticles, pseudovirions
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Tereza Tomanová 10.15 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Tereza Tomanová 41 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Tereza Tomanová 41 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Hana Španielová, Ph.D. 244 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Martina Saláková, Ph.D. 132 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D. 153 kB