velikost textu

Stanovenie nízkomolekulárneho heparínu pomocou afinitnej kapilárnej elektroforézy

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Stanovenie nízkomolekulárneho heparínu pomocou afinitnej kapilárnej elektroforézy
Název v češtině:
Stanovení nízkomolekulárního heparinu pomocí afinitní kapilární elektroforézy
Název v angličtině:
Determination of low-molecular-mass heparin using affinity capillary electrophoresis
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Katarína Molnárová
Vedoucí:
RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Jana Sobotníková, Ph.D.
Id práce:
195249
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Analytická chemie (NANALD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
30. 5. 2019
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Slovenština
Klíčová slova:
kapilárna elektroforéza, nízkomolekulárny heparín, afinitná interakcia
Klíčová slova v angličtině:
capillary electrophoresis, low-molecular-mass heparin, affinity interactions
Abstrakt:
Abstrakt Štandardný heparín, klinický antikoagulant, je v praxi čoraz častejšie nahradený nízkomolekulárnymi heparínmi. Tie sa používajú kvôli lepším biologickým vlastnostiam, medzi ktoré patrí lepšie predvídateľný antikoagulačný účinok, menej krvácavých komplikácií a lepšia biologická dostupnosť. Hladina nízkomolekulárnych heparínov v krvi je zvyčajne stanovená anti–Xa testom. Toto stanovenie však naráža na isté nedostatky. Táto práca sa venuje stanoveniu nízkomolekulárneho heparínu, Fraxiparínu, pomocou afinitnej kapilárnej elektroforézy. Pretože heparíny sú polysacharidy, ktoré významne neabsorbujú v UV oblasti, ich priama detekcia je náročná. Z toho dôvodu v rámci tejto práce bola použitá nepriama detekcia Fraxiparínu, pričom bola využitá jeho schopnosť tvoriť komplex s protamínom - antidotum heparínu. Protamín je pozitívne nabitý peptid, ktorý má zložitú štruktúru, jeho hlavnou zložkou je však arginín. Z toho dôvodu bol, z účelu stanovenia Fraxiparínu, protamín nahradený tetraarginínom, ktorý má dobre definovanú štruktúru. Základným elektrolytom bola kyselina fosforečná s koncentráciou 9 mmol l-1 s prídavkom 0,1% (w/v) hydroxyetylcelulózy. Základné experimentálne usporiadanie používalo zónové dávkovanie, pričom jednotlivé zóny boli nadávkované tlakom 5 kPa. Ako prvá bola nadávkovaná zóna Fraxiparínu, hneď potom bola dávkovaná zóna tetraarginínu (5 s). Následne bolo aplikované napätie 30 kV po dobu 30 s, počas ktorého jednotlivé zóny migrujú cez seba, čím dôjde k vzniku komplexu Fraxiparín-tetraarginín. Na stanovenie Fraxiparínu bol použitý zvyškový voľný tetraarginín, ktorý bol detegovaný pri vlnovej dĺžke 200 nm. Doba dávkovania Fraxiparínu bola jeden z predmetov optimalizácie. Ďalej bola optimalizovaná celková dĺžka kapiláry, z dôvodu dosiahnutia čo najpriaznivejšej doby stanovenia. Optimalizovaná metóda používala kapiláru s celkovou dĺžkou 40,0 cm (efektívna dĺžka 31,5 cm). Fraxiparín bol dávkovaný 120 s a tetraarginín 5 s. Aby sa roztoky v kapiláre príliš nezahrievali separačné napätie, ktoré bolo aplikované po dobu 30 s, bolo znížené na 20 kV. Následne boli prevedené pokusy, týkajúce sa stanovenia Fraxiparínu v krvnej plazme. Na deproteinizáciu plazmy bol testovaný acetonitril, acetón a kyselina trifluóroctová. Kľúčové slová kapilárna elektroforéza, nízkomolekulárny heparín, afinitná interakcia
Abstract v angličtině:
Abstract Unfractionated heparin, which is a widely used anticoagulant, is frequently replaced with low-molecular-mass species. They are used due to their more predictable anticoagulant effect with less bleeding complications and also they have prolonged anticoagulant effect. For monitoring of low-molecular-mass heparin levels, anti‒factor Xa assay is used, which has some significant drawbacks. This work is dedicated to determination of low-molecular-mass heparin, namely Fraxiparine, using affinity capillary electrophoresis. Heparin is a polysaccharide which does not exhibit a significant UV absorption; therefore, its indirect detection method was used. Fraxiparine forms a stable complex with protamine. Protamine is an arginine‒rich, positively charged peptide which is used to suppress heparin anticoagulant effect. Because protamine has a complex, not precisely defined structure, it was replaced by well-defined tetraarginine. The method uses phosphoric acid of 9 mmol L‒1 concentration with addition of 0.1% (w/v) hydroxyethylcellulose as the background electrolyte. The samples are injected hydrodynamically into the capillary by a pressure of 5 kPa. First, the zone of Fraxiparine was injected, followed by the zone of tetraarginine (5 s). After that, 30 kV voltage was applied for 30 s. During this time the zones migrate through each other, which enables formation of the complex. Fraxiparine was determined from the amount of remaining free tetraarginine detected at a wavelength of 200 nm. The injection time of Fraxiparine was subject to optimization. The total length of the capillary was optimized, too. The optimal method uses a capillary of 40.0 cm total length (effective length was 31.5 cm). Fraxiparine was injected for 120 s, tetraarginine for 5 s. The voltage was reduced to 20 kV (30 s) to make sure that the solutions will not overheat. After the optimization, different experiments were performed due to the determination of Fraxiparine in blood plasma. Acetonitrile, acetone and trifluoroacetic acid were tested for deproteination of the samples. Keywords capillary electrophoresis, low-molecular-mass heparin, affinity interactions
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Katarína Molnárová 3.68 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Katarína Molnárová 199 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Katarína Molnárová 191 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D. 381 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Jana Sobotníková, Ph.D. 252 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Ivan Jelínek, CSc. 152 kB