velikost textu

Novel approaches for development of in vitro liver cell models

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Novel approaches for development of in vitro liver cell models
Název v češtině:
Nové přístupy ve vývoji in vitro jaterních buněčných modelů
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Tomáš Smutný
Vedoucí:
Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D.
Oponenti:
doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D.
doc. PharmDr. Peter Kollár, Ph.D.
Id práce:
191410
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra farmakologie a toxikologie (16-16170)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
22. 9. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Abstrakt:
Abstrakt Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakologie a toxikologie Kandidát: Mgr. Tomáš Smutný Školitel: prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Název dizertační práce: Nové přístupy ve vývoji in vitro jaterních buněčných modelů Játra jsou hlavním metabolickým orgánem v lidském těle. Odhad jaterního metabolismu je tak důležitým krokem při vývoji léčiv. Neméně důležité je také vyhodnocení rizika jaterního poškození navozeného potencionálními léčivy. Některé parametry spojené s metabolismem a toxicitou vyvíjených léčiv mohou být predikovány pomocí in vitro jaterních buněčných modelů. Dnes jsou za jejich zlatý standard považovány primární lidské hepatocyty. Vedle nich se uplatňují další jaterní modelové systémy, jako jsou jaterní tkáňové řezy, subcelulární frakce, jaterní nádorové buněčné linie a hepatocyty odvozené od kmenových buněk. Soudobé in vitro modely mají stále řadu nevýhod, a to i navzdory pokrokům v jejich vývoji. Ty směřují k lepšímu odhadu farmakokinetických a toxikologických parametrů testovaných kandidátních léčiv. Jednou z nevýhod jaterních modelů je jejich nedostatečná podobnost s in vivo fenotypem spojená s nízkou metabolickou kapacitou. V posledních několika letech jsme byli svědky ohromujícího postupu nových technologií zaměřujících se na zlepšení stávajících jaterních buněčných modelů (například zavedení 3D modelů, kultivace buněk několika typů v jednom systému nebo využití perfúzních kultur). Cíle této dizertační práce můžeme rozdělit do tří částí. Nejdříve jsme se pokusili zesílit metabolickou kapacitu in vitro jaterních buněčných modelů za použití malých molekul, které jsou aktivátory důležitých jaderných receptorů zapojených v regulaci enzymů metabolizujících léčiva (drug-metabolizing enzymes (DMEs)). Převážně jsme využili jaterní nádorové buněčné linie, protože mají rychlý a neomezený růst, dobrou dostupnost a snadno se s nimi pracuje. Na druhé straně postrádají mnoho DMEs. Posledně jmenovaná skutečnost nás vedla k tomu, abychom se také zabývali vlivem post- transkripčních a post-translačních modifikací klíčových regulátorů DMEs. Tyto modifikace by mohly vnést více světla do fenoménu nízké exprese DMEs v buněčných jaterních linií. Nakonec jsme se zaměřili na využití in vitro jaterních modelů (včetně 1 hepatocytů dovozených od kmenových buněk) pro hodnocení hepatotoxicity nově vyvíjených kandidátních léčiv a suspektních hepatotoxinů odvozených od léčivých rostlin. V naší první studii jsme identifikovali inhibitory MEK1/2 jako silné aktivátory genů podrodiny CYP3A v běžně používané hepatocelulární nádorové buněčné linii HepG2. Tyto výsledky jsou důležité, neboť izoforma CYP3A4, která metabolizuje více než 30 % všech klinicky používaných léčiv, je omezeně exprimována v této buněčné linii a dalších jaterních buněčných modelech. V této práci jsme se navíc pokusili dešifrovat mechanismus stojící za tímto fenoménem. V druhé práci jsme identifikovali několik nových látek fungujících jako ligandy významných xenosenzorů (např. jaderných receptorů PXR a CAR a transkripčního faktoru AhR). Xenozenzory jsou zapojené do genové regulace DMEs. Můžeme proto předpokládat, že tyto malé molekuly mouhou být využity k zesílení exprese významných genů DMEs v jaterních in vitro modelech. V další práci jsme se zaměřili na in silico predikci microRNAs (miRNAs), které mají potenciál ovlivnit expresi jaderných receptorů zapojených do regulace CYP3A4. Předpokládá se, že účinek miRNAs na regulaci jadernách receptorů by se mohl podílet na interindividuální variabilitě v expresi CYP3A4. Můžeme vyslovit hypotézu, že námi predikované miRNAs by mohly mít dopad na expresi DMEs v jaterních in vitro buněčných modelech. Lepší znalosti o regulatorní síti kontrolující funkce PXR a dalších jaderných receptorů mohou vést k modifikacím in vitro jaterních modelů a umožnit optimalizaci jejich vlastností blíže směrem k in vivo fenotypu. V naší další studii jsme se pokusili odhadnout toxicitu nově připravených látek s potenciální antituberkulotickou aktivitou. Pro tento účel jsme použili primární lidské hepatocyty a čtyři odlišné savčí buněčné linie zahrnující jaterní linie HuH-7 a HepG2. Mitochondriální aktivitu (měřenou pomocí MTS testu) jsme zvolili jako znak buněčné viability. Ze studie vyplývá, že námi testované molekuly vykazovaly až na několik výjimek nízkou buněčnou toxicitu. V současné době vyhodnocujeme uplatnění indukovaných hepatocytům podobných buněk (induced hepatocyte-like cells (iHep cells)) pro toxikologický 2 screening (připravovaná publikace). Pro validaci modelu jsme v této analýze použili několik hepatotoxických fytochemikálií s rozdílným mechanismem toxicity. Dále jsme porovnali iHep buňky s HepG2 buňkami a primárními hepatocyty. Věříme, že naše připravovaná studie může přinést informace o pozici komerčně dostupných iHep buněk v toxikologických aplikacích. Náš výzkum přinesl některé nové malé molekuly použitelné pro úpravu metabolické kapacity současných in vitro jaterních modelů. Dále jsme popsali některé aspekty post-transkripční a post-translační modifikace stojící za regulací enzymů metabolizujících léčiva. V neposlední řadě jsme využili in vitro buněčných modelů pro odhad hepatoxicity nově syntetizovaných kandidátních léčiv s potenciální antituberkulotickou aktivitou a suspektních hepatotoxinů odvozených z léčivých rostlin. 3
Abstract v angličtině:
Abstract Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmacology and Toxicology Candidate: Tomáš Smutný, MSc. Supervisor: Prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Title of doctoral thesis: Novel approaches for development of in vitro liver cell models. The liver is a main metabolizing organ in the body. Therefore, the evaluation of hepatic metabolism is a crucial step during drug development. Moreover, a liver damage induced by drugs is another task to be assessed in drug development. In vitro liver cell models allow addressing some of these concerns. Up to date, primary human hepatocytes are considered as a “gold” standard of in vitro liver cell models. Additionally, other liver model systems are used such as liver tissue slices, subcellular fractions, liver cancer cell lines and hepatocytes derived from stem cells. Despite the significant progress towards right estimation of pharmacokinetic and toxicological parameters of drug candidates during drug development, current in vitro systems still suffer from various drawbacks. One of these limitations is their insufficient similarity with in vivo-like phenotype associated with low metabolic capacity of the models. In last several years, we were victims of tremendous effort to improve existing models such as 3D models, co-culture and perfusion cultures. Aims of this thesis can be divided into three parts. Firstly, we tried to enhance metabolic capacity of in vitro liver cell models using small molecules, which are activators of crucial nuclear receptors controlling expression of drug-metabolizing enzymes (DMEs). Liver cancer cell lines were predominantly utilized since these cells have fast and unlimited life-span, good availability and easy handling but lack many DMEs. Secondly, we focused on the impact of post-transcriptional and post-translational modifications of key regulators of DMEs, which could also shed some light on the phenomenon of low DMEs expression in common liver cell lines. Finally, we applied in vitro liver cell models including stem cell-derived hepatocytes for a hepatotoxicity assessment of newly developed drug candidates and suspected hepatotoxicans-derived from medical plants. 1 In our first study, we identified MEK1/2 inhibitors as strong activators CYP3A subfamily genes in commonly used hepatocellular carcinoma cell line HepG2. These results are important since CYP3A4 isoform metabolizes more than 30% of all clinically used drugs and it is poorly expressed in this cell line as well as in other liver cell models. Furthermore, we attempted to decipher the mechanism underlying this phenomenon. Secondly, we identified several new compounds functioning as “pan- xenosensors” ligands. Since nuclear receptors (NRs) such as PXR, CAR and transcription factor AhR are involved in the gene regulation of DMEs, we suppose that these small molecules can be used for the boosting of DME gene expression in in vitro liver models. In another study, we focused on in silico prediction of microRNAs (miRNAs) targeting NRs, which are associated with CYP3A4 regulation. We and other groups suggested that the effect of miRNAs on the regulation of NRs could participate in CYP3A4 interindividual expression variability. We can hypothesize that our predicted miRNAs could have an impact on the expression of DMEs in in vitro liver cell models. The better knowledge about the regulatory network controlling PXR (and other NRs) functions can lead to possible modifications of in vitro liver models allowing to optimize their properties closer to in vivo-like phenotype. In our next study, we tried to estimate a toxicity of newly synthesized compounds with a potential antituberculotic activity. To fulfill the aim of the study, we used primary human hepatocytes and four different mammalian cell lines including hepatic HuH-7 and HepG2 cells. The mitochondrial activity measured by MTS assay was selected as a marker of a cell viability. Our tested molecules revealed generally low cellular toxicity with several exceptions. Currently, we evaluate induced hepatocyte-like cells (iHep cells) for toxicological screening in our preparing manuscript (not yet published). For this analysis, we used several hepatotoxic phytochemicals with different mode of toxicity to validate model sensitivity and compared iHep cells with HepG2 cells and primary hepatocytes. We believe that such analysis can bring a reference point for tracking of a position of currently available iHep cells for toxicological applications. Collectively, our investigation brought some novel small molecules used for the adjustment metabolic capacity of current in vitro liver models. Moreover, we 2 described some aspects of post-transcriptional and post-translational modifications involved in DME regulation. Finally, we applied in vitro cell models for the prediction of hepatotoxicity of newly synthesized drug candidates with a potential antituberculotic activity and suspected hepatotoxicans-derived from medical plants. 3
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Tomáš Smutný 8 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Tomáš Smutný 267 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Tomáš Smutný 265 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Doc. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. 298 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Stanislav Mičuda, Ph.D. 124 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. PharmDr. Peter Kollár, Ph.D. 124 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 214 kB