velikost textu

Structural composition and functional properties of mitochondrial FoF1 ATP synthase on models of specific subunits deficiencies

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Structural composition and functional properties of mitochondrial FoF1 ATP synthase on models of specific subunits deficiencies
Název v češtině:
Analýza podjednotkového složení a funkce mitochondriální FoF1 ATP syntázy u modelů deficience strukturních podjednotek
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Iuliia Efimova
Vedoucí:
RNDr. Tomáš Mráček, Ph.D.
Oponent:
doc. RNDr. Martin Kalous, CSc.
Id práce:
186542
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Buněčná a vývojová biologie (NBUNVYB)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
17. 9. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
mitochondrie, oxidační fosforylace, FoF1 ATP syntáza, energetický metabolizmus
Klíčová slova v angličtině:
mitochondria, oxidative phosphorylation, FoF1 ATP synthase, energy metabolism
Abstrakt:
Abstrakt Mitochondriální ATP syntáza je posledním z komplexů oxidačně fosforylačního (OXPHOS) systému lokalizovaného na vnitřní mitochondriální membráně. Její hlavní funkcí je využití mitochondriálního membránového potenciálu (Δψm) vytvořeného komplexy elektron transportního řetězce (ETC) k produkci energie ve formě ATP. Savčí ATP syntáza je sestavená ze 17 různých podjednotek, které jsou organizovány do membránové Fo a do matrix směřující F1 domény. Defekty komplexu V a jejich projevy na úrovni mitochondrií, buněk, tkání i celého organizmu byly zkoumány na různých modelech, včetně lidských buněčných linií odvozených z tkání pacientů. V mnoha případech vykazují mitochondriální onemocnění tzv. prahový efekt (efekt thresholdu), při kterém se defekt na úrovni genu fenotypově projeví pouze v případě poklesu enzymové aktivity a/nebo obsahu konkrétního komplexu pod určitou prahovou hodnotu. Tato práce byla zaměřená na objasnění funkčních dopadů deficience ATP syntázy u HEK293 buněčných linií s potlačenou expresí γ, δ nebo ε podjednotek centrálního stonku ATP syntázy. Analyzovali jsme řadu klonů s utišenou expresí uvedených podjednotek a ukázali na proměnlivé snížení obsahu sestavené ATP syntázy, kterému odpovídalo i snížení obsahu jednotlivých podjednotek tohoto enzymu. Jedinou výjimkou byla podjednotka Fo-c, jejíž obsah se nesnižoval spolu s ostatními podjednotkami a u některých z klonů byl dokonce zvýšen. Deficience ATP syntázy měla za následek snížení viability buněk za podmínek limitace živinami, které se projevilo jako threshold v knockdown klonech (KD) se zbytkovým obsahem ATP syntázy nižším než 50 %. Snížená funkční kapacita ATP syntázy byla následně charakterizována u nejvíce postíženého klonu, kdy jsme pozorovali pokles respiračních kontrolních indexů. Zatímco obsah ATP syntázy u studovaných klonů byl snížen v rozmezí 90- 15 % v porovnání s kontrolou, ostatní OXPHOS komplexy vykazovaly variabilně zvýšenou expresi, pravděpodobně v důsledku kompenzace. Dále jsme zavedli techniku afinitní purifikace ATP syntázy pomocí vazby IF1 inhibičního proteinu. Připravili jsme dostatečné množství rekombinantního IF1 proteinu, který vykazoval schopnost vázat se na ATP syntázu a v praxi ověřili použitelnost metodiky pro izolaci ATP syntázy z mitochondrií potkanních jater. Izolovaná ATP syntáza nebyla kontaminována ostatními OXPHOS komplexy. Daná metoda bude použitelná k budoucí charakterizaci modelů s deficiencí ATP syntázy, jako například i modelů utišění podjednotek centrálního stonku. Klíčová slova: mitochondrie, ATP syntáza, deficience, prahový efekt, biogeneze, afinitní purifikace
Abstract v angličtině:
Abstract Mitochondrial ATP synthase represents the final complex of oxidative phosphorylation (OXPHOS) system located in the inner mitochondrial membrane. Its primary role is to utilize mitochondrial membrane potential (Δψm) generated by respiratory chain complexes to produce energy in the form of ATP. Mammalian ATP synthase comprises of 17 different subunits organized into membranous Fo and matrix-oriented F1 domains. Defects of complex V and their manifestation have been studied on mitochondrial, cellular, tissue and organism levels using different models, including human cell lines and cell lines derived from patient tissues. In many cases mitochondrial diseases display threshold behaviour, when genetic defect is phenotypically manifested only bellow certain threshold in particular enzyme complex activity and/or content. This work was aimed at elucidation of functional consequences of ATP synthase deficiency in HEK293 cell lines with suppressed gene expression of γ, δ or ε subunits of ATP synthase central stalk. We have analysed range of clones with respective subunits knockdown and found varying decrease in assembled ATP synthase content, which was mirrored by the decrease in individual ATP synthase subunits. The only exception was subunit Fo-c, whose levels remained unchanged or even increased. ATP synthase deficiency translated into limitation of cell viability, which was manifested under nutrient limiting conditions as a threshold in knockdown clones (KD) harbouring less than 50 % of residual ATP synthase content. Decreased functional capacity of ATP synthase was further characterized in the most severely affected clone, where we observed decrease in respiratory control indexes. While ATP synthase content showed decrease in the range of 90-15 % compared to controls, other OXPHOS complexes displayed variable compensatory upregulation. Next, we adapted the technique of ATP synthase affinity purification through the IF1 inhibitory protein. We prepared sufficient quantities of recombinant IF1 protein construct, verified its ability to bind ATP synthase and performed proof-of-concept isolation of ATP synthase from rat liver mitochondria. Isolated ATP synthase was devoud of contamination by other OXPHOS complexes. This approach will be available for future characterisation of ATP synthase dysfunction models, such as knockdowns of the central stalk. Key words: mitochondria, ATP synthase, deficiency, threshold effect, biogenesis, affinity purification
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Iuliia Efimova 5.12 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Iuliia Efimova 204 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Iuliia Efimova 197 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Tomáš Mráček, Ph.D. 164 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Martin Kalous, CSc. 429 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Petr Folk, CSc. 154 kB