velikost textu

The role of tissue specific isoforms of subunit 4 in assembly and function of cytochrome c oxidase

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
The role of tissue specific isoforms of subunit 4 in assembly and function of cytochrome c oxidase
Název v češtině:
Úloha tkáňově specifických izoforem podjednotky 4 v sestavování a funkci cytochrom c oxidázy
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Kristýna Čunátová
Vedoucí:
Mgr. Petr Pecina, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Mgr. Lukáš Stibůrek, Ph.D.
Id práce:
186380
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Buněčná a vývojová biologie (NBUNVYB)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
5. 6. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
cytochrom c oxidáza, COX, Cox4 izoformy, Cox4i1, Cox4i2, CRISPR
Klíčová slova v angličtině:
cytochrome c oxidase, COX, Cox4 isoforms, Cox4i1, Cox4i2, CRISPR
Abstrakt:
Abstrakt Systém oxidační fosforylace (OXPHOS) je zodpovědný za produkci naprosté většiny ATP v savčích organismech. Tento proces, lokalizovaný ve vnitřní mitochondriální membráně, je mimo jiné regulován jaderně kódovanými podjednotkami cytochrom c oxidázy (COX), která je terminálním enzymem elektron transportního řetězce. Podjednotka Cox4 se účastní regulace OXPHOS systému a spolu s podjednotkou Cox1 utváří první intermediát v sestavování COX. Není-li tento intermediát správně sestaven, nedojde následně ke vložení Cox2 katalytické podjednotky a tím k maturaci katalyticky funkčního COX enzymu. Mimo to je Cox4 podjednotka přítomna ve dvou izoformách (Cox4i1, Cox4i2), které hypoteticky slouží k optimalizaci funkce respiračního řetězce během změn v zásobování tkání kyslíkem. Funkční dopad výměny izoforem nebyl nicméně doposud v savčích tkáních a buňkách podrobně prozkoumán. V rámci této práce byly pomocí CRISPR CAS9-10A párující nikázy připraveny jedinečné modely HEK293 buněk s úplnou absencí (knock-out, KO) podjednotky Cox4, a byly dále charakterizovány. Vyřazení funkce obou izoforem Cox4i1 a Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO klony) vedlo ke generalizovanému snížení COX podjednotek spojenému s úplnou absencí sestavené COX. Množství detekovaných podjednotek komplexu I, stejně jako obsah sestaveného komplexu I, byly sníženy u COX4i1/4i2 KO klonů. Naopak, množství komplexu II, komplexu III a komplexu V nebylo výrazně narušeno. V souladu s tímto pozorováním i metabolické značení 13 mitochondriálně kódovaných proteinů odhalilo narušení proteosyntézy podjednotek COX i komplexu I, zatímco komplex III a komplex V nebyly ovlivněny. Změny mitochondriální proteosyntézy rovněž korelovaly se sníženým množstvím mitochondriálních ribozomálních proteinů. Dle očekávání nebyla u COX4i1/4i2 KO klonů detekována mitochondriální respirace, jejíž nefunkčnost byla kompenzována zvýšenou glykolytickou kapacitou. COX4i1/4i2 KO modely připravené v HEK293 buněčné linii vykazovaly fenotyp úplné ztráty COX, vedoucí k plné závislosti buněk na nemitochondriální ATP produkci. Navrhujeme, že narušení mitochondriální proteosyntézy představuje sekundární efekt dysfunkce elektron transportního řetězce. COX4i1/4i2 dvojité KO klony připravené v rámci předkládané diplomové práce budou použity jako nástroj pro vytvoření knock-in modelů Cox4i1 i Cox4i2 izoformy, které poslouží k objasnění jejich biologické úlohy. Klíčová slova: cytochrom c oxidáza, COX, Cox4 izoformy, Cox4i1, Cox4i2, CRISPR
Abstract v angličtině:
Abstract Oxidative phosphorylation apparatus (OXPHOS) is responsible for production of majority of ATP in mammalian organisms. This process, occurring in the inner mitochondrial membrane, is partly regulated by nuclear-encoded subunits of cytochrome c oxidase (COX), the terminal enzyme of electron transport chain. Cox4 subunit, participating in OXPHOS regulation, is an early-assembly state subunit, which is necessary for incorporation of Cox2 catalytic subunit, thus for assembly of catalytically functional COX enzyme. Moreover, regulated expression of two isoforms (Cox4i1, Cox4i2) of Cox4 subunit is hypothesized to optimize respiratory chain function according to tissue oxygen supply. However, the functional impact of the isoform switch for mammalian tissues and cells is still only partly understood. In the present thesis, unique HEK293 cell line-based model with complete absence of subunit Cox4 (knock-out, KO) was prepared employing novel CRISPR CAS9-10A paired nickase technology and further characterized. Knock-out of both isoforms Cox4i1 and Cox4i2 (COX4i1/4i2 KO clones) showed general decrease of majority of Cox subunits resulting in total absence of fully assembled COX. Moreover, detected Complex I subunits as well as the content of assembled Complex I were decreased in COX4i1/4i2 KO clones. On the contrary, levels of Complex II, Complex III, and Complex V were not significantly affected. Pulse-chase metabolic labelling of 13 mtDNA-encoded proteins synthesized in mitochondria uncovered impairment of COX and Complex I subunits proteosynthesis, while Complex III and Complex V subunits were not significantly affected. Correspondingly, partial impairment of mitochondrial proteosynthesis correlated with decreased level of mitochondrial ribosomal proteins. As expected, mitochondrial respiration was undetected in COX4i1/4i2 KO cells, and was compensated by increased glycolytic capacity. In summary, the HEK293 cell line-based cellular model of COX4i1/4i2 KO displayed phenotype of total COX absence, making cells fully reliant on OXPHOS-independent ATP production. In addition, we hypothesise that the impairment of mitochondrial proteosynthesis represents a secondary effect of electron transport chain dysfunction. COX4i1/4i2 double KO prepared in this project will serve as a tool for knock-in of either Cox4i1 or Cox4i2 isoform to clarify biological role of these isoforms. Key words: cytochrome c oxidase, COX, Cox4 isoforms, Cox4i1, Cox4i2, CRISPR
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Kristýna Čunátová 3.86 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Kristýna Čunátová 96 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Kristýna Čunátová 97 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Petr Pecina, Ph.D. 497 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Mgr. Lukáš Stibůrek, Ph.D. 59 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. František Půta, CSc. 154 kB