Stability of protein complexes in the cytoskeleton of the eukaryotic flagellum

Název:

Název v češtině:

Stabilita proteinových komplexů cytoskeletu eukaryotického bičíku

Typ:

Diplomová práce

Autor:

Mgr. Martina Pružincová

Vedoucí:

Mgr. Vladimír Varga, Ph.D.

Oponent:

Mgr. Lukáš Čajánek

Id práce:

186369

Fakulta:

Přírodovědecká fakulta (PřF)

Pracoviště:

Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)

Program studia:

Biologie (N1501)

Obor studia:

Genetika, molekulární biologie a virologie (NGEMOVI)

Přidělovaný titul:

Mgr.

Datum obhajoby:

10. 9. 2019

Výsledek obhajoby:

Výborně

Jazyk práce:

Angličtina

Klíčová slova:

cília, bičík, axonéma, proteínová obmena, inkorporácia proteínov, Trypanosoma brucei, HaloTag

Klíčová slova v angličtině:

cilium, flagellum, axoneme, turnover, protein incorporation, Trypanosoma brucei, HaloTag

Abstrakt:

Abstrakt Cília/bičík je komplexná organela vystupujúca z tela bunky, ktorá môže mať niekoľko funkcií, ako napríklad pohybovú, senzorickú alebo signálnu. Bičík je zostavený zo stoviek proteínov, ktorých väčšina tvorí kostru – mikrotubulárnu axonému. Pretože bičík neobsahuje ribozómy, proteíny, ktoré sa podieľajú na jeho stavbe a funkcii, musia byť dovážané z tela bunky a inkorporované na správne pozície. Navyše, tieto proteíny si musia zachovávať svoju funkciu počas dlhého obdobia, a to napriek tomu, že sú vystavené mechanickému a environmentálnemu stresu. Tieto skutočnosti vzbudzujú otázku, či a kde dochádza v bičíku k výmene proteínov. Predchádzajúce štúdie bičíkov na Chlamydomonas reinhardtii prezentovali, že bičík je dynamická štruktúra (Marshall & Rosenbaum, 2001). Naopak, štúdie na Trypanosoma brucei ukázali, že bičíky tohto organizmu sú pozoruhodne stabilné (Vincensini et al., 2018). Avšak to, akým spôsobom sa bičík vytvára a stabilizuje, bolo doteraz skúmané iba na veľmi malom počte proteínov a iba v krátkych časových intervaloch. Navyše, tieto experimenty využívali expresiu študovaných proteínov s neprirodzenými regulačnými mechanizmami. Na objasnenie detailov spôsobu fungovania proteínovej obmeny v bičíku bola v tejto práci použitá T. brucei. Jedným z dôvodov výberu tohto modelového organizmu bolo to, že T. brucei má schopnosť homologickej rekombinácie génov, čo umožňuje rýchlu produkciu značených proteínov. Na označenie týchto proteínov boli použité fluorescenčné značky, ktorými bolo pozorované celkové množstvo proteínu v bunke a takzvaný HaloTag, ktorý umožňoval označenie proteínov nachádzajúcich sa v bunke v jedinom konkrétnom čase. Prezentované experimenty ukázali, že proteíny všetkých hlavných axonemálnych komplexov sa zabudovávajú výlučne zo vzdialeného konca bičíka. Jedným z prekvapivých zistení tejto práce bolo pozorovanie proteínovej obmeny vo vyzretom bičíku. K tejto obmene dochádza počas cytokinézy a to výlučne v oblasti na vzdialenom konci bičíka. Ďalším zaujímavým pozorovaním je, že skúmané axonemálne proteíny majú rozlične veľké cytoplazmické zásoby. V závere táto práca predstavuje systematickú analýzu rastu a proteínovej obmeny hlavných axonemálnych komplexov a prispieva tak k lepšiemu pochopeniu biológie bičíka. Kľúčové slová: cília, bičík, axonéma, proteínová obmena, inkorporácia proteínov, Trypanosoma brucei, HaloTag

Abstract v angličtině:

Abstract The cilium/flagellum is a complex organelle protruding from the cell body and functioning in motility, sensing, and signalling. It is composed of hundreds of protein constituents, the majority of which comprise the flagellar cytoskeleton – the microtubule-based axoneme. Because the flagellum lacks ribosomes, its protein constituents have to be imported from the cell body and delivered to proper locations. Moreover, these proteins have to retain their function over a considerable length of time, despite the mechanical stress caused by flagellar beating and due to environmental exposure. This raises the question whether and where protein turnover occurs. Previously, it was established that Chlamydomonas reinhardtii flagella are dynamic structures (Marshall & Rosenbaum, 2001). In contrast, in the Trypanosoma brucei flagellum axonemal proteins are remarkably stable (Vincensini et al., 2018). However, the questions of axonemal assembly and stability were so far investigated only for a small number of proteins and during relatively short periods. Moreover, in these experiments expression of studied proteins was controlled by non-native regulatory elements. To elucidate the site of incorporation of proteins from all major axonemal complexes and to find out if and where the protein turnover occurs, T. brucei as a model organism was selected. T. brucei is capable of homology recombination, which enables rapid protein tagging in their endogenous loci. Examined proteins were fused to two tags – a fluorescent protein to monitor total protein in the cell and the HaloTag enabling labelling of the protein molecules present in the cell at a particular time and monitor their behaviour thereafter. These experiments confirmed that the addition of constituents of all major axonemal complexes to a growing axoneme occurs exclusively at its distal end. Surprisingly, the turnover of these proteins in mature flagella of T. brucei was observed. This turnover happens around cytokinesis and exclusively affects a short region at the distal end of the flagellum. Finally, the data indicate differences in relative cytoplasmic pools of the studied axonemal proteins. In conclusion, this work provides a systematic analysis of the axonemal growth and turnover, contribution to the knowledge of these aspects of basic flagellar biology. Keywords: cilium, flagellum, axoneme, turnover, protein incorporation, Trypanosoma brucei, HaloTag

Dokumenty

Stáhnout	Dokument	Autor	Velikost
Stáhnout	Text práce	Mgr. Martina Pružincová	4.3 MB
Stáhnout	Abstrakt v českém jazyce	Mgr. Martina Pružincová	505 kB
Stáhnout	Abstrakt anglicky	Mgr. Martina Pružincová	497 kB
Stáhnout	Posudek vedoucího	Mgr. Vladimír Varga, Ph.D.	485 kB
Stáhnout	Posudek oponenta	Mgr. Lukáš Čajánek	2.33 MB
Stáhnout	Záznam o průběhu obhajoby	RNDr. Irena Lichá, CSc.	154 kB

Repozitář závěrečných prací

Veřejné aplikace

Stability of protein complexes in the cytoskeleton of the eukaryotic flagellum