velikost textu

Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Identification of small compounds disrupting protein-protein interaction in influenza A polymerase.
Název v češtině:
Identifikace sloučenin rozrušujících protein-proteinovou interakci u polymerasy viru chřipky.
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Jakub Hejdánek
Vedoucí:
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Oponent:
doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D.
Id práce:
185804
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyzikální a makromol. chemie (31-260)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Biofyzikální chemie (NBIOFYZD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
23. 5. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Informace o neveřejnosti:
Zveřejnění práce bylo odloženo do 23.05.2021
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
polymerasa viru chřipky, protein-proteinová interakce, vysokokapacitní testovací metoda pro hledání sloučenin, proteinová krystalografie, testovací metoda AlphaScreen, testovací metoda DIANA
Klíčová slova v angličtině:
influenza polymerase, protein-protein interaction, high-throughput screening assay, protein crystallography, AlphaScreen assay, DNA-linked inhibitor antibody assay
Abstrakt:
Abstrakt Virus chřipky napadá ptactvo a savce a způsobuje u nich závažnou infekci, která je ročně příčinou téměř půl milionu lidských obětí. Dodnes jsou terapeutickými cíly pouze dvě molekuly v životním cyklu viru – M2 protonový kanál a neuraminidasa. Vznik nových pandemických subtypů je současně s vývojem resistentních variant proti současným lékům závažným podnětem pro nalezení nových cílů a potenciálně jejich inhibitorů. V nedávné době byla pomocí strukturní krystalografie identifikována protein-proteinová interakce mezi PA a PB1 podjednotkou virové polymerasy jakožto zajímavý therapeutický cíl. Zajímavé je, že tato interakce je zprostředkována jen několika interagujícími aminokyselinovými zbytky. Další zajímavý fakt je, že tyto zbytky vykazují vysokou konzervovanost mezi variantami viru chřipky typu A, což by v případě nalezení inhibitoru mohlo umožnit zacílit širokospektrální léčbu proti všem kmenům tohoto typu viru. V této práci jsem se zabýval expresí a purifikací dvou fúzních rekombinantních proteinových konstruktů C-terminální domény PA podjednotky (CPA) z pandemického subtypu viru chřipky A/California/07/2009 (H1N1). První konstrukt byl navrhnut k evaulaci kinetických vlastností interakce mezi PB1 peptidem a CPA proteinem. Dále byl tento konstrukt použit k vývoji vysoko-kapacitní testovací analýzy látek na bázi technologie AlphaScreen. Pomocí této analýzy jsme testovali zkracované PB1 peptidy s úmyslem vyhledat minimální peptid, který by si zachoval vazebné vastnosti vůči proteinu CPA. Dále jsem navrhl druhý rekombinantní protein sestávající se z hexahistidinové kotvy spojené s proteinem SUMO zlepšujícím rozpustnost, vázaným na CPA protein. Tento protein byl po odštepení fúzní kotvy následně využit pro krystalizační experimenty metodou difuze par, které vedly k získání 3D struktury poskytující informace využitelné v racionálním návrhu léčiv. Na závěr byla navržena další vysokokapacitní testovací metoda pro hledání sloučenin v knihovnách pro nalezení nových látek rozrušujících protein-proteinové interakce. Klíčová slova: polymerasa viru chřipky, protein-proteinová interakce, vysokokapacitní testovací metoda pro hledání sloučenin, proteinová krystalografie, testovací metoda AlphaScreen, testovací metoda DIANA
Abstract v angličtině:
Abstract Influenza virus causes severe respiratory infections in birds and mammals and it is responsible for up to half a million deaths of human beings worldwide each year. Two molecular targets in influenza viral life cycle, neuraminidase and M2 proton channel are exploited in treatment. However, the recent emergence of new pandemic type along with increasing resistance against approved drugs has urged the need for a new drug target discovery and potential search of its inhibitor. Recently, an interesting protein-protein interaction between two subunits PA and PB1 of influenza A viral polymerase has been identified by X-ray crystallography as a new promising drug target. The fact that relatively few residues drive the binding and that the binding interface is highly conserved presents an intriguing possibility to identify antiviral lead compounds effective against all subtypes of influenza A virus. In our laboratory, we expressed and purified two fusion tag constructs of the recombinant C-terminal domain of polymerase acidic subunit (CPA) from the pandemic isolate A/California/07/2009 H1N1. First, GST-CPA fusion protein was used for kinetic evaluation of PA-PB1 interaction by surface plasmon resonance. Moreover, this construct was used in the development of high-throughput screening method for search of interaction disrupting molecules based on AlphaScreen technology. We utilized this assay to determine the effect of truncating minimal PB1 peptide responsible for mediating CPA-PB1 interaction. Furthermore, we designed additional construct of CPA fused with protein His6- SUMO for efficient over-expression and subsequent crystallization experiments. We set up co-crystallization experiments by the vapor-diffusion method and were later able to obtain 3D structure disclosing information employable in rational drug design. Lastly, the secondary high-throughput screening assay is being developed in order to screen broad compound libraries for the search of novel inhibitors. Keywords: influenza polymerase, protein-protein interaction, high-throughput screening assay, protein crystallography, AlphaScreen assay, DNA-linked inhibitor antibody assay
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Jakub Hejdánek 3.75 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Jakub Hejdánek 95 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Jakub Hejdánek 94 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. 366 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. 487 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Miroslav Štěpánek, Ph.D. 152 kB