velikost textu

Studium strukturně funkčních vztahů elektrotransportních proteinových systémů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Studium strukturně funkčních vztahů elektrotransportních proteinových systémů
Název v angličtině:
Structure-functional study of electrotransport protein systems
Typ:
Bakalářská práce
Autor:
Bc. Roman Tuzhilkin
Vedoucí:
doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Zdeněk Kukačka
Konzultant:
prof. Antonín Vlček, CSc.
Id práce:
185374
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (B1406)
Obor studia:
Biochemie (BBIO)
Přidělovaný titul:
Bc.
Datum obhajoby:
13. 6. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
azurin, foto-Met, technika fotochemického zesítění (PIXL), elektronový transport
Klíčová slova v angličtině:
azurin, photo-Met, photo-induced crosslinking (PIXL), electron transport
Abstrakt:
Abstrakt Studium procesů spojených s přenosem elektronu v proteinech je velice důležitou oblastí moderní biochemie a strukturní/funkční proteomiky. Azurin je jedním z nejpoužívanějších modelových systémů pro studium oxidačně-redukčních a elektron transportních procesů v proteinech. V této práci jsme použili metodiku kovalentního fotochemického zesítění (PIXL) pro studium oligomerizace azurinu v roztoku. Zároveň jsme studovali vliv L-2- amino-5,5-azi-hexanové kyseliny (foto-Met), strukturního světlem indukovatelného analogu přirozené aminokyseliny Met, na elektron transportní procesy v azurinu. Byla provedena optimalizace podmínek exprese rekombinantního azurinu v auxotrofních buňkách E. coli B834 za účelem získání azurinu s maximální mírou inkorporace foto-Met (70% inkorporace určená MALDI-TOF hmotnostní spektrometrií). Současně modifikací purifikačního protokolu (např. rozbití buněk, kyselá precipitace proteinů, zavedení kovového ligandu při sonikaci buněk) jsme zvýšili čistotu a výtěžek preparátu a zkrátili dobu purifikace. Získané preparáty azurinu (přirozený protein (WT) s Met, WT s foto-Met a „All-Phe“ mutant (všechny Trp/Tyr zaměněny za Phe) s foto-Met) byly po ozáření UV světlem (metodika PIXL) charakterizovány pomocí UV-VIS spektroskopie a SDS-PAGE. Při experimentu PIXL některý z foto-Met zavedených do azurinu se v závislosti na iontové síle podílel na: (i) tvorbě kovalentního dimeru, (ii) intramolekulárního spojení, (iii) měnil oxidoredukční stav iontu mědi v aktivním centru (pokles hodnoty maxima absorbance při 635 nm v UV-VIS spektrech po ozáření). Po vyloučení příspěvku Trp/Tyr („All-Phe“ mutant s foto-Met) nebo příspěvku foto-Met (WT s Met) na tvorbu (generování) UV-světlem aktivovaných stavů můžeme konstatovat, že strukturní fotoaktivovatelný analog foto-Met může při ozáření intenzivním UV-světlem generovat intermediáty, které jsou následně schopné redukovat atom mědi v aktivním centru azurinu. Klíčova slova: azurin, foto-Met, technika fotochemického zesítění, elektronový transport
Abstract v angličtině:
Abstract Electron transport processes are an extremely important field of study in modern biochemistry and structural/functional proteomics. Azurin is one of the most utilised model systems for study of redox and electron transport processes in proteins. We have utilised photo-induced crosslinking (PIXL) to study oligomerization of azurin in solution and the effect of L-2-amino-5,5-azi-hexanoic acid (photo-Met) – a structural photoinducible analogue of canonical amino acid Met – on electron transport processes in azurin. The optimisation of expression conditions of recombinant azurin in auxotrophic E. coli B834 cells was done to maximise photo-Met incorporation percentage in azurin sequence (70% incorporation was measured via MALDI-TOF mass spectrometry). Through the optimisation of purification protocol (example: cell disintegration, acid precipitation of proteins, adding metallic ligand during cell sonication) we have increased the purity and yield of final product and reduced the purification time. Final preparations (wild-type azurin (WT) with Met, WT with photo-Met and “All-Phe” mutant (all Trp/Tyr replaced by Phe) with photo-Met) were exposed to intense UV-light (PIXL) and evaluated via UV-VIS spectroscopy and SDS-PAGE. During PIXL experiment some photo-Mets incorporated into azurin were able to: (i) form covalent dimers, (ii) link azurin intramolecularly, (iii) alter redox state of copper ion at the active site (decreased value of absorbance maximum at 635 nm on UV-VIS spectrum after irradiation). Those effects were dependent on the ionic strength. We have excluded the effect of Trp/Tyr (“All-Phe” mutant with photo-Met) or the effect of photo-Met (WT with Met) on UV-light generated species. Therefore we can claim that UV-light generates intermediates of photo-Met which are able to reduce copper ion at azurin’s active site. Key words: azurin, photo-Met, photo-induced crosslinking, electron transport In Czech
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Roman Tuzhilkin 3.24 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Roman Tuzhilkin 256 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Roman Tuzhilkin 252 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D. 254 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Zdeněk Kukačka 483 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Petr Hodek, CSc. 153 kB
Stáhnout Errata Bc. Roman Tuzhilkin 221 kB