velikost textu

Modifikace myších nádorových linií systémem CRISPR/Cas9 a charakterizace jejich vlastností

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Modifikace myších nádorových linií systémem CRISPR/Cas9 a charakterizace jejich vlastností
Název v angličtině:
Modification of murine tumor cell lines with CRISPR/Cas9 system and their characterization
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Karolína Lhotáková
Vedoucí:
RNDr. Ingrid Poláková, Ph.D.
Oponent:
doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D.
Id práce:
185340
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Imunologie (NIMUN)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
24. 1. 2019
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
MHCI, β2-mikroglobulin, nádory, protinádorová imunita, DNA imunizace, CRISPR/Cas9
Klíčová slova v angličtině:
MHCI, β2-microglobulin, tumors, antitumor immunity, DNA immunization, CRISPR/Cas9
Abstrakt:
Abstrakt Molekuly MHCI jsou konstitutivně exprimované na všech jaderných buňkách organismu a hrají klíčovou roli v prezentaci antigenů CD8+ T lymfocytům. Nádorové buňky využívají jako jeden z nejčastějších mechanismů vyhnutí se imunitní odpovědi právě snížení exprese MHCI. To má za následek znemožnění cytotoxickým CD8+ T lymfocytům rozeznat nádorové buňky a vést proti nim imunitní odpověď. Jelikož ke snížení exprese MHCI dochází až u 90 % některých typů nádorů, je třeba mít k dispozici klinicky relevantní model nádorů s ireverzibilně sníženou expresí MHCI, na kterém by bylo možno testovat různé imunoterapeutické přístupy. Tato práce popisuje přípravu nové modelové linie nádorových buněk TC-1 s ireverzibilně sníženou expresí MHCI. Toho bylo dosaženo inaktivací B2m, jež je součástí MHCI molekuly, pomocí systému CRISPR/Cas9. Inaktivace B2m u modifikovaných buněčných linií byla ověřena průtokovou cytometrií, western blotem a sekvenací jednotlivých alel. Po této inaktivaci došlo ke zpomalení růstu nádorových buněk jak in vitro, tak in vivo. Metastatická aktivita buněk nebyla ovlivněna. Nádory vytvořené buňkami s inaktivovaným B2m nejsou citlivé k DNA imunizaci cílené proti onkoproteinu E7 z HPV16 provedené vakcínou pBSC/PADRE.E7GGG. Hlavními efektorovými buňkami v imunitě proti těmto nádorům jsou NK1.1+ buňky. Při terapeutických pokusech se opakovaně podařilo dosáhnout zpomalení růstu nádorů při kombinaci DNA vakcinace s adjuvans ODN1826 ve srovnání se samotnou DNA imunizací. Při kombinaci dvou adjuvancií, ODN1826 a α-Tim3, DNA vakcína protinádorový účinek nezvyšovala.
Abstract v angličtině:
Abstract MHCI molecules are constitutively expressed in all nucleated cells and play a key role in antigen presentation to CD8+ T lymphocytes. One of the tumor immune evasion strategies is MHCI expression downregulation. This leads to an impaired recognition of tumor antigens by CD8+ T lymphocytes that are unable to start the immune response. Since the MHCI expression downregulation occurs in up to 90 % of some tumors it is neccesary to have a clinical relevant tumor model without a MHCI surface expression that would be used for testing of immunotherapeutic approaches. This thesis describes a production of new model cell lines of TC-1 tumor cells with irreversibly downregulated MHCI. That was achieved by an inactivation of B2m, which is a part of MHCI, by gene editing using CRISR/Cas9. The B2m inactivation was confirmed by flow cytometry, western blot and sanger sequencing of single alleles. The inactivation slowed down the cell growth for both in vitro and in vivo. The cell metastatic activity was not affected. The tumors established by cells without the B2m expression are not sensitive to DNA vaccine against HPV16 E7 oncoprotein by a pBSC/PADRE.E7GGG vaccine. The main effector function against these tumors possess the NK1.1+ cells. In a therapeutic vaccination experiment it was repeatedly achieved of tumor growth deceleration by combining DNA vaccination and ODN1826 adjuvans. DNA vaccination did not increase an antitumo effect when using the combination of ODN1826 and αTim-3.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Karolína Lhotáková 3.17 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Karolína Lhotáková 170 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Karolína Lhotáková 167 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Ingrid Poláková, Ph.D. 130 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D. 211 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Jan Černý, Ph.D. 152 kB