text size

Vliv transkripčních regulačních elementů na sestřih pre-mRNA

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Title:
Vliv transkripčních regulačních elementů na sestřih pre-mRNA
Titile (in english):
Influence of transcription regulatory elemets on pre-mRNA splicing
Type:
Diploma thesis
Author:
Bc. Martin Volek
Supervisor:
doc. Mgr. David Staněk, Ph.D.
Opponent:
MUDr. Radek Malík
Thesis Id:
185229
Faculty:
Faculty of Science (PřF)
Department:
Department of Genetics and Microbiology (31-140)
Study programm:
Biology (N1501)
Study branch:
Genetics, Molecular Biology and Virology (NGEMOVI)
Degree granted:
Mgr.
Defence date:
01/06/2018
Defence result:
Excellent
Publication of the thesis:
The thesis publication was postponed to 01.06.2021
Language:
Czech
Keywords (in czech):
transkripční enhancr, fibronektin, sestřih pre-mRNA
Keywords:
transcription enhancer. fibronectin, pre-mRNA splicing
Abstract (in czech):
ABSTRAKT Při sestřihu pre-mRNA jsou z pre-mRNA odstraněny introny a dochází ke spojení exonů. Současné studie dokazují, že až 95 % genů, které mají více než dva exony, se mohou účastnit alternativního sestřihu pre-mRNA, tedy procesu, při kterém může či nemusí dojít k zahrnutí exonu do výsledné mRNA. Většina sestřihu pre-mRNA se uskutečňuje kotranskripčně, tedy v době, kdy je RNA polymerása II stále spojena s pre-mRNA. Alternativní sestřih je velmi komplikovaný a komplexní proces, který probíhá v blízkosti DNA a histonů, jež mohou tento proces ovlivňovat. Předchozí studie validovaly gen fibronektinu (FN1) a jeho alternativní exony EDA a EDB (extra doména A a B) jako vhodné modely pro studium alternativního sestřihu. Studie používající minireportérový systém FN1 skládající se z exonu EDA, dvou sousedních intronů a exonů dokázaly, že při vnesení transkripčního enhanceru SV40 před promotor tohoto systému, dochází ke snížení zahrnutí exonu EDA ve výsledné mRNA. Není však známe, zda obdobný mechanizmus funguje i mimo reportérový systém v genomu a zda vzdálené transkripční regulační elementy mohou mít vliv na alternativní sestřih. Proto byl pomocí programů The Ensemble Regulatory Build a FANTOM 5 identifikován potenciální transkripční enhancer, který se nachází 23,5 kbp před místem začátku transkripce (TSS) pro gen FN1. Jeho nejdelší predikovaná varianta měla 2 401 bp. Použitím CRISPR/Cas9 technologie se podařilo připravit tři linie odvozené od HeLa buněk, ze kterých byl tento transkripční element odstraněn. Použitím kvantitativní a semikvantitativní PCR bylo zjištěno, že ve všech připravených HeLa KO liniích vzrůstá transkripce genu FN1 a výrazně klesá míra zahrnutí alternativního exonu EDB do výsledné mRNA. Deletovaná oblast byla tedy transkripčním represorem nikoli enhancerem, který zároveň moduluje alternativní sestřih. Výsledky tak ukazují, že alternativní sestřih může být ovlivňován i značně vzdálenými regulačními úseky DNA, které mohou napomáhat vzniku určité sestřihové varianty mRNA. Klíčová slova: alternativní sestřih pre-mRNA, transkripční represor, gen FN1, exon EDB, CRISPR/Cas9
Abstract:
ABSTRACT In the process of pre-mRNA splicing introns are removed from pre-mRNA and exons are joined together. Current studies show, that about 95 % of genes, which contain more than two exons, can undergo alternative splicing. In this process some exons are included in or excluded from the final mRNA. Majority of pre-mRNA splicing take place co- transcriptionaly at this time RNA polymerase II is still attached to pre-mRNA. Alternative splicing is complex process that takes place in a close proximity of DNA and histones that might modulate alternative splicing decisions. Futher studies have validated fibronectin gene (FN1) and his alternative exons EDA and EDB (extra domain A and B) as suitably model for studying alternative splicing. Study using FN1 minigene reporter system, which is composed from EDA exon and two surrounding introns and exons, has proved that insertion of transcription enhancer SV40 infront of promotor, the level of EDA inclusion is decreased. So far, has not been prooved if this mechanism can function in real genome context and if distal transcription elements can influence alternative splicing. In this study, we have predicted transcription enhancer for FN1 gene by using The Ensemble Regulatory Build and FANTOM 5. The predicted transcription enhancer, is located 23,5 kbp upstream of TSS for FN1 gene and was 2 401 bp long. We have prepared by using CRISPR/Cas9 system three HeLa cell lines, from which was this transcription element removed. Results from quantitative and semiquantitative PCR showed, that after removal of predicted transcription enhancer, increase level of transcription of FN1 gene in all prepared clones. More importantly the deleted sequence wasn’t transcription enhancer, but transcription silencer. From our results we concluded, that alternative splicing can be influenced even by distal transcription regulatory elements, which can promote splicing of one alternative splicing variant. Key words: alternative splicing, transcription silencer, FN1 gene, EDB exon, CRISPR/Cas9
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Bc. Martin Volek 3.52 MB
Download Abstract in czech Bc. Martin Volek 250 kB
Download Abstract in english Bc. Martin Volek 247 kB
Download Supervisor's review doc. Mgr. David Staněk, Ph.D. 361 kB
Download Opponent's review MUDr. Radek Malík 1.26 MB
Download Defence's report RNDr. Martin Pospíšek, Ph.D. 154 kB