velikost textu

Možné přístupy k terapii cystické fibrosy

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Možné přístupy k terapii cystické fibrosy
Název v angličtině:
Possible approaches to the treatment of cystic fibrosis
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Jan Král
Vedoucí:
RNDr. Lucie Bořek Dohalská, Ph.D.
Oponent:
Mgr. Libuše Nosková
Id práce:
184984
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (N1406)
Obor studia:
Biochemie (NBIOD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
21. 5. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Cystická fibróza je genetické onemocnění způsobené mutací v CFTR genu. To má za následek absenci či špatnou funkčnost CFTR chloridového kanálu, který je i zásadním regulátorem dalších iontových kanálů. Tato práce se zaměřila na studium genové terapie cystické fibrózy pomocí genového přenosu CFTR-mRNA. K určení exprese CFTR proteinu bylo použito metod nepřímé imunofluorescence a Western blot imunodetekce. Zároveň byla stanovena relativní míra genové exprese CFTR genu pomocí kvantitativní PCR. K experimentům byly použity buněčné linie zdravého plicního epitelu (NuLi-1), plicního epitelu s homozygotní mutací F508del (CuFi-1) a zárodečného ledvinného epitelu (HEK293S). CFTR protein byl vizualizován uvedenými metodami pomocí šesti primárních protilátek (432, 450, 570, 596, 769, CF3). Pro detekci CFTR proteinu pomocí metody nepřímé imunofluorescence byly jako nejvhodnější vybrány primární protilátky 570 a CF3. V případě metody Western blot byla pro detekci uvedeného proteinu vhodná pouze protilátka CF3. Stanovením relativní míry genové exprese CFTR genu bylo zjištěno, že tento gen je exprimován u studovaných buněčných linií v malém množství, přičemž míra jeho exprese je v buněčné linii CuFi-1 přibližně šestkrát vyšší než v buněčné linii NuLi-1. Byla zkoumána též účinnost transfekce buněčné linie CuFi-1 pomocí CFTR-mRNA. Buněčná linie byla transfekována dvěma druhy in vitro syntetizované CFTR-mRNA obsahující: a) nemodifikované nukleotidy, b) 25 % pseudouridinu a 25 % 5-methylcytidinu. Transfekce buněčné linie oběma druhy CFTR-mRNA vedla ke zvýšení množství CFTR proteinu v buňkách. Navíc bylo zjištěno, že CFTR-mRNA s nemodifikovanými nukleotidy působila na buňky toxicky již v nízkých koncentracích (0,5 μg/ml). Oproti tomu CFTR-mRNA s modifikovanými nukleotidy působila toxicky až při koncentraci 2,0 μg/ml. Transfekce pomocí CFTR-mRNA tedy představuje teoreticky možný způsob terapie cystické fibrózy. Klíčová slova: Cystická fibróza, genová terapie, CFTR protein, nepřímá imunofluorescence, Western blot, kvantitativní PCR, přenos mRNA.
Abstract v angličtině:
Abstract Cystic fibrosis is a genetic disease caused by a mutation in the CFTR gene. This leads to an absence or a malfunction of CFTR chloride channel, which is also a crutial regulator of other ion channels. This thesis was aimed at gene therapy of cystic fibrosis using CFTR- mRNA gene transfer. To determine the expression of CFTR protein, methods of indirect immunofluorescence and Western blot immunodetection were utilized. Also relative gene expression levels of CFTR gene were assessed by quantitative PCR. Experiments were carried out on a healthy lung epithelial cell line (NuLi-1), a lung epithelial cell line with F508del mutation (CuFi-1) and an embryonic kidney epithelial cell line (HEK293S). CFTR protein was visualized by previously mentioned methods using six primary antiobodies (432, 450, 570, 596, 769, CF3). Primary antibodies 570 a CF3 were found as optimal for the detection of CFTR protein by the method of indirect immunofluorescence, whereas for the detection of this protein by the method of Western blot only the CF3 antibody was suitable. It was also determined that CFTR gene is expressed in overall small levels. Its relative gene expression in the CuFi-1 cell line was approximately six times higher than in the NuLi-1 cell line. The efficiency of transfection of CuFi-1 cell line by CFTR-mRNA was also studied. The cell line was transfected by two types of in vitro synthetised CFTR-mRNA containing: a) unmodified nucleotides, and b) 25 % of pseudouridine and 25 % of 7-methylcytidine. Transfection of the cell line by both types of CFTR-mRNA resulted in increased levels of CFTR protein. CFTR-mRNA with unmodified nucleotides was found to be toxic even at small concentration (0,5 μg/ml). CFTR-mRNA with modified nucleotides was, however, found to be toxic only at concentration 2,0 μg/ml. In conclusion, transfection by CFTR- mRNA is a theoretically possible way of treatment of the cystic fibrosis. Key words: Cystic fibrosis, gene therapy, CFTR protein, indirect immunofluorescence, Western blot, quantitative PCR, mRNA transfer.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Jan Král 4.5 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Jan Král 268 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Jan Král 261 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Lucie Bořek Dohalská, Ph.D. 248 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Libuše Nosková 292 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Petr Hodek, CSc. 154 kB