velikost textu

Nepřímé stanovení heparinu kapilární elektroforézou

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Nepřímé stanovení heparinu kapilární elektroforézou
Název v angličtině:
Indirect determination of heparin by capillary electrophoresis
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Barbora Filounová
Vedoucí:
RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D.
Oponent:
RNDr. Anna Kubíčková, Ph.D.
Id práce:
184523
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Chemie (N1407)
Obor studia:
Analytická chemie (NANALD)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
31. 5. 2018
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
kapilární elektroforéza, heparin, tetraarginin
Klíčová slova v angličtině:
capillary electrophoresis, heparin, tetraarginine
Abstrakt:
Abstrakt Heparin je směs sulfatovaných polysacharidů s negativním nábojem. Jde o látku, která je v organismu velmi důležitá a zásadním způsobem zasahuje do jeho fyziologie. Hlavní funkce heparinu v těle je protisrážlivá – zabraňuje tomu, aby došlo k úplnému sražení krve. Zásahem do koagulační kaskády jeho antikoagulační efekt vyrovnává hemokoagulační efekt. V některých případech je třeba do této rovnováhy zasáhnout farmakologicky, kdy se aplikuje heparin ve formě sodné nebo vápenaté soli ve fyziologickém roztoku jako antikoagulační přípravek. Sledování hladiny heparinu v krvi nebo plasmě má svá úskalí. Dodnes používané metody jsou založeny na jednoduchém principu měření času potřebného k vzniku sraženiny krve ve vzorku – vyhodnocení je prováděno vzhledem k porovnávacím roztokům. Tyto metody jsou relativně nepřesné, nedají se použít v „on-line“ uspořádání a jsou velmi ovlivňovány celkovým zdravotním stavem pacienta. V rámci této práce byly převzaty a ověřeny některé ze základních principů metody afinitní kapilární elektroforézy, kde byl heparin sledován nepřímo pomocí úbytku píku protaminu. Protamin se používá jako antidotum heparinu, protože s ním tvoří stabilní komplex. V této práci byl složitější protamin nahrazen dobře definovaným tetraargininem, jelikož arginin je v protaminu nejhojněji zastoupená aminokyselina. Byla optimalizována metoda, která využívala 10 mM kyselinu fosforečnou jako základní elektrolyt. Do základního elektrolytu byly tlakem 5 kPa dávkovány dvě zóny, a to roztok heparinu (120 s) a poté roztok tetraargininu (3 s). Poté bylo na kapiláru vloženo napětí 30 kV po dobu 30 s a zóny migrovaly proti sobě, což způsobilo vznik komplexu heparin- tetraarginin. Vzniklé zóny byly mobilizovány skrz detektor ven z kapiláry. Zbylý tetraarginin se zaznamenával pomocí UV detektoru při 200 nm a koncentrace heparinu byla vyhodnocena na základě úbytku plochy píku. Do roztoků bylo také pro zlepšení citlivosti a opakovatelnosti přidáno známé množství roztoku heparinu a do základního elektrolytu hydroxyehtylcelulosa. Za těchto podmínek bylo dosaženo LOD 1,1 µg/ml a LOQ 3,8 µg/ml.
Abstract v angličtině:
Abstract Heparin is a mixture of sulfonated polysaccharides which is negatively charged. Heparin is a substance which is important in organism and fundamentally affects its physiology. Main attribute of heparin is anticoagulation – it prevents the complete blood coagulation. This anticoagulant effect balances the hemocoagulation by influencing the coagulation pathway. In some cases a pharmacological application of heparin is needed so the heparin is administrated as a injection of physiological solution of sodium or calcium heparine salt. Monitoring of level of the heparin in blood is problematic – methods used today are based on the measurement of a time required for blood clot formation. The result evaluation is done by comparing a sample with reference solution. These methods are relatively imprecise, can not be used in „on-line“ setting and are highly influenced by general health condition of patient. In this work some principles of affinity capillary electrophoresis were adapted from another work – heparin was determined indirectly by monitoring of decrease of the peak area of protamine. Protamine is medically used antidote of heparin because they create a stable complex together. In this work protamine was replaced by well defined tetraarginine because the most frequent amino acid in protamine is arginine. The method was optimized – 10 mM phosphoric acid is used as background electrolyte. Two zones are hydrodynamically (5 kPa) injected into the capillary. First is heparine (120 s) and second tetraarginine (3 s). After injection 30 kV voltage is applied for 30 seconds – the zones migrate through each other so the complex is formed. Zones are then mobilized through detector out of capillary. The electropherogram of unattached tetraarginine is recorded spectrophotometrically (200 nm). The concentration of heparin in solution is calculated according to the decrease of the peak area of tetraarginine. To improve sensitivity and run-to-run repeatibility a known amount of heparin was added to calibration solutions and hydroxyethylcelulose was added to background electrolyte. Using these conditions LOD was calculated as 1,1 µg/ml and LOQ as 3,8 µg/ml.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Barbora Filounová 1.31 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Barbora Filounová 91 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Barbora Filounová 90 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D. 381 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Anna Kubíčková, Ph.D. 163 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Ivan Jelínek, CSc. 154 kB