velikost textu

Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů
Název v angličtině:
Development and applications of affinity carrier for isolation of human carbonyl-reducing enzymes
Typ:
Rigorózní práce
Autor:
Mgr. Rudolf Andrýs
Vedoucí:
Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D.
Oponenti:
prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D.
Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D.
Id práce:
180266
Fakulta:
Farmaceutická fakulta v Hradci Králové (FaF)
Pracoviště:
Katedra biochemických věd (16-16160)
Program studia:
Farmacie (M5206)
Obor studia:
Farmacie (FAR)
Přidělovaný titul:
PharmDr.
Datum obhajoby:
10. 2. 2017
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Rudolf Andrýs Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce: VÝVOJ A APLIKACE AFINITNÍHO NOSIČE PRO IZOLACI LIDSKÝCH KARBONYL-REDUKUJÍCÍCH ENZYMŮ Již po několik tisíciletí tvoří základ lidské medicíny malé bioaktivní molekuly, které byly podávány ve formě rostlinných extraktů nebo syntetický připravených sloučenin. Jejich využití v moderní lékařské vědě ovšem není možné bez detailního porozumění jejich biochemických účinků a identifikace jejich molekulárních cílů. Metody chemické proteomiky, založené na specifické interakci mezi bioaktivní látkou a cílovou molekulou, patří v současné době k nejpoužívanějším technikám při identifikaci molekulárních cílů malých molekul. Oproti klasickým biochemickým metodám (např. 2D elektroforéza) se jedná o citlivé a především velmi selektivní techniky, díky kterým lze z komplexních biologických vzorků úspěšně identifikovat i biomolekuly, které se přirozeně vyskytují jen ve velmi malých koncentracích. Takovými biomolekulami jsou i karbonyl-redukující enzymy, které představují fyziologicky důležitou skupinu proteinů, jelikož se podílí na metabolismu řady endogenních (např. prostaglandiny, steroidní hormony) i xenobiotických (např. antracykliny, oracin) sloučenin. I když je většina dosud charakterizovaných karbonyl-redukujících enzymů cytosolických, v nadrodině dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR) se nachází i řada membránově vázaných zástupců. Znalosti o jejich podílu na metabolismu xenobiotik ale zatím nejsou příliš velké. Výzkumem stereospecifity redukce potenciálního protinádorového léčiva oracinu však byla zjištěna přítomnost dosud neznámých mikrosomálních karbonyl- redukujících enzymů, které se podílí na jeho metabolismu. Dosavadní pokusy o jejich purifikaci ovšem skončily nezdarem. Ačkoli byly získány proteinové frakce, které vykazovaly metabolickou aktivitu vůči oracinu i požadovanou stereospecifitu jeho redukce, využitím neselektivních purifikačních technik (iontově-výměnná chromatografie, hydrofobně-interakční chromatografie) nebylo možné obsažené enzymy získat v dostatečném množství a čistotě pro jejich následnou identifikaci pomocí MS. Cílem tohoto projektu bylo vytvoření originálního afinitního nosiče schopného selektivně izolovat karbonyl-redukující enzymy z komplexních biologických vzorků. Za tímto účelem byla testována sada magnetických i nemagnetických částic, na které bylo různými způsoby imobilizováno potenciální protinádorové léčivo oracin. Afinitní nosič s nejlepšími vlastnostmi byl následně testován se sérií čistých rekombinantně připravených enzymů a s buněčnými homogenáty obsahujícími overexprimované cílové enzymy. Ve všech případech bylo prokázáno, že námi připravený afinitní nosič s imobilizovaným léčivem oracinem byl schopen izolovat karbonyl-redukující enzymy, které mají afinitu vůči oracinu. Afinitní nosič byl následně zařazen do purifikačního protokolu membránově vázaných karbonyl-redukujících enzymů z lidské jaterní tkáně. Byly tak získány proteinové frakce s metabolickou aktivitou vůči oracinu i požadovanou stereospecifitou jeho redukce. Metodou hmotnostní spektrometrie byly v těchto frakcích následně identifikovány mikrosomální enzymy DHRS1, RDH16 a17β-HSD6 bez známé afinity a metabolické aktivity vůči oracinu. Dále byl identifikován enzym 11β-HSD1, u kterého byla afinita vůči oracinu popsána již dříve. U enzymů DHRS1 a RDH16 byla afinita vůči oracinu následně potvrzena u rekombinantně připravených enzymů. Tyto rekombinantní formy ale zatím bohužel nepotvrdili významnou metabolickou aktivitu vůči tomuto léčivu. Potvrzení jejich afinity vůči tomuto xenobiotickému substrátu ovšem může naznačovat jejich další potenciální roli v biotransformaci jiných xenobiotik.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Rudolf Andrýs Supervisor: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Title of dissertation thesis: DEVELOPMENT AND APPLICATION OF AFFINITY CARRIER FOR ISOLATION OF HUMAN CARBONYL-REDUCING ENZYMES For several millennia the human medicine is based on application of small bioactive molecules that are administered in the form of plant extracts or synthetic compounds. However, their use in modern medicine is not possible without a detailed understanding of their biochemical effects and identification of their molecular targets. Chemical proteomics based on the specific recognition between the bioactive molecule and the target molecule is currently the most widely used techniques for identification of molecular targets of small molecules. Compared to conventional biochemical methods (e.g. 2D electrophoresis), chemical proteomics represents particularly sensitive and very selective technique that enable successful identification of biomolecules from complex biological samples that are naturally presented in very small concentrations. Carbonyl- reducing enzymes, which play an important role in physiology due to their involvement in metabolism of various endogenous (e.g. prostaglandins, steroid hormones) and xenobiotic (e.g. anthracyclines, oracin) substrates, also represent such low abundance biomolecules. Although the majority of today known carbonyl-reducing enzymes represent soluble proteins, there are many membrane-bound members in short chain dehydrogenases/reductases (SDR) superfamily. However, the knowledge on their role in metabolism of xenobiotics is quite poor. Based on the research on the reduction stereospecificity of anticancer drug oracin, there were predicted microsomal carbonyl- reducing enzymes involved in the metabolism and inactivation. However, previous attempts to purify these enzyme failed. Although the obtained protein fractions exhibited metabolic activity towards oracin with desired stereospecificity, using non-selective purification techniques (ion-exchange chromatography, hydrophobic-interaction chromatography) was not possible to obtain desired enzymes in sufficient quantity and purity for their subsequent identification by MS. The aim of this project was to develop suitable affinity carrier capable to selectively purify carbonyl-reducing enzymes from complex biological samples. For this purpose several types of magnetic and non-magnetic beads were modified with anticancer drug oracin to form an affinity carrier. The carrier showing the best binding capacity was subsequently tested with a series of pure carbonyl-reducing enzymes and complex biological samples. The in-house developed affinity carrier was able to capture carbonyl- reducing enzymes having affinity towards oracin in all cases. Thus, affinity carrier was implemented into purification protocol of human microsomal carbonyl-reducing enzymes. Obtained fractions exhibited metabolic activity towards oracin with desired stereospecificity of its reduction. Using mass spectrometry proteins DHRS1, RDH16 and 17β-HSD6, with unknown affinity and metabolic activity towards oracin were successfully isolated and identified. Furthermore, enzyme 11β-HSD1 with already described affinity towards oracin was identified too. The affinity of enzymes DHRS1 and RDH16 towards oracin was subsequently demonstrated by using recombinant proteins. Although these recombinant proteins have not confirmed significant metabolic activity of this drug yet, their isolation and identification as its potential molecular target may indicate their role in biotransformation of other xenobiotics.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Rudolf Andrýs 3.93 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Rudolf Andrýs 1.46 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Rudolf Andrýs 117 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Rudolf Andrýs 124 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. 112 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D. 160 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. RNDr. Dalibor Šatínský, Ph.D. 111 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 78 kB