velikost textu

Modulace funkce RNA demetylázy FTO v SH-SY5Y buňkách: vliv na insulinovou signalizaci a mitochondriální respiraci

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Modulace funkce RNA demetylázy FTO v SH-SY5Y buňkách: vliv na insulinovou signalizaci a mitochondriální respiraci
Název v angličtině:
Modulation of RNA demethylase FTO function in SH-SY5Y cells: the effect on insulin signaling and mitochondrial respiration
Typ:
Diplomová práce
Autor:
Bc. Zuzana Čočková
Vedoucí:
doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc.
Oponent:
Mgr. Markéta Hlaváčková, Ph.D.
Konzultant:
Mgr. Petr Telenský, Ph.D.
Id práce:
171889
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra fyziologie (31-152)
Program studia:
Biologie (N1501)
Obor studia:
Fyziologie živočichů (NFYZZIV)
Přidělovaný titul:
Mgr.
Datum obhajoby:
7. 9. 2017
Výsledek obhajoby:
Výborně
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
FTO; mitochondrie; insulinová signalizace; rhein; energetický metabolismus
Klíčová slova v angličtině:
FTO; mitochondria; insulin signaling; rhein; energetic metabolism
Abstrakt:
Abstrakt Cílem práce bylo pozorovat vliv inhibice funkce FTO na oxidativní metabolismus a expresní profil neuroenergeticky významných proteinů v modelové linii lidských neuronálních buněk SH- SY5Y. FTO je enzym demetylující N6-metyladenosin ve strukturách RNA. Změny v expresi enzymu jsou doprovázeny poměrně širokým spektrem efektů souvisejících s energetickou homeostázou. Mitochondrie jsou místem tvorby energie, metabolicky významných substrátů, ale také potenciálně nebezpečných reaktivních forem kyslíku a jiných molekul. V popředí zájmu proto bylo studium mitochondriálního respiračního řetězce. Experimenty vysokorezoluční respirometrie ukázaly, že ovlivnění buněk inhibitorem FTO je doprovázeno změnami v mitochondriální respiraci. Pozorována byla zejména snížená endogenní respirace buněk a významný pokles byl zaznamenán v maximální a rezervní kapacitě elektron-transportního řetězce. Vyšší koncentrace používaného inhibitoru navíc vedla k markantnějším změnám v respiraci. Dále byla metodou Western blotu kvantifikována exprese komplexů dýchacího řetězce. Ve shodě s výše zmíněnými výsledky se ukázalo, že buňky ovlivněné inhibitorem FTO mají snížené hladiny podjednotek některých komplexů. Určitý pokles byl zaznamenán u podjednotek komplexů I a IV. Zdaleka nejvýraznější rozdíl byl však pozorován u komplexu II. Žádné změny nebyly zjištěny u podjednotek komplexu III a ATP syntázy. Mitochondriální dysfunkci může doprovázet nefyziologická míra produkce ROS. Využitím fluorescenčních sond H2DCFDA a DHE se podařilo naměřit vyšší hladiny ROS v případě pokusné skupiny buněk s inhibovaným FTO. Druhým stěžejním tématem práce byla insulinová signalizace. Metodou Western blotu byly identifikovány změny v expresi vybraných proteinů insulinové signalizační dráhy. Po inhibici FTO se zvýšily hladiny insulinového receptoru, a také insulin degradujícího enzymu. Poměry p-Akt/Akt a p-p38/p38 se výrazně snížily, naopak bylo pozorováno zvýšení poměru p-ERK/ERK. Bez signifikantních změn zůstala exprese p110 podjednotky PI3K a poměr p-GSK3β/GSK3β. Výsledky této práce naznačují, že aktivita FTO ovlivňuje metabolické a signalizační pochody uvnitř neuronálních buněk. Další studium tohoto enzymu může bezpochyby přispět k hlubšímu pochopení bioenergetických pochodů nervového systému.
Abstract v angličtině:
Abstract Aim of this thesis was to observe changes in oxidative metabolism and expression of important neuroenergetic proteins in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y due to inhibition of FTO. FTO is a RNA demethylase that uses N6-methyladenosine as substrate. Differences in enzyme expression are connected to broad area of effects involving energy homeostasis. Mitochondria are cellular powerhouses, a key elements in production of energy and metabolic substrates, yet a source of potentially dangerous reactive oxygen species (ROS) and analogous reactive molecules. In order to better understand FTO purpose in neuronal energetic metabolism, we examined mitochondrial respiratory chain. Using high-resolution respirometry we were capable of observing impairment in mitochondrial respiration after FTO inhibition. There was considerable decline in endogenous respiration, maximal respiration rate and reserve capacity. In order to obtain more detailed view into mitochondrial respiration, expression levels of electron-transport complexes were quantified by Western blot technique. Slight reduction was identified in subunits of complex I and IV. However, the most prominent alteration was seen in complex II subunit. There were no differences in expression of complex III and ATP synthase subunits. Beside disrupted activity of electron-transport system, ROS production can reflect mitochondrial dysfunction. By using fluorescence probes, we managed to observe increased ROS production in cells treated with FTO inhibitor. Furthermore, we studied how FTO inhibition affects insulin signaling. Expression of selected proteins involved in insulin signaling was detected by Western blot. Increased levels of insulin receptor and insulin degrading enzyme accompanied FTO inhibition. Additionally, decreased ratio of p-Akt/Akt and p-p38/p38 together with elevated ratio of p-ERK/ERK was observed. Minimal difference was sighted in PI3K p110 expression or p-GSK3β/GSK3β ratio. Taken together, these results suggest considerable link between FTO activity and neuronal signaling and metabolic actions. Further research could undoubtedly prove to be beneficial in gaining knowledge about bioenergetics processes in the nervous system.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Zuzana Čočková 3.68 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Zuzana Čočková 197 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Zuzana Čočková 193 kB
Stáhnout Posudek vedoucího doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc. 231 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Markéta Hlaváčková, Ph.D. 246 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Jiří Novotný, DSc. 153 kB