velikost textu

Investigation and inhibition of α-synuclein aggregation

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Investigation and inhibition of α-synuclein aggregation
Název v češtině:
Výzkum a inhibice agregace alfa-synukleinu
Typ:
Disertační práce
Autor:
Kseniia Afitska, Ph.D.
Školitel:
Dmytro Yushchenko, Dr.
Oponenti:
Doc., Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D.
Id práce:
171405
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra biochemie (31-250)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
17. 12. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
agregace proteinů, alpha-Synuclein, fluorescentní proby, inhibitory, proteinové značky
Klíčová slova v angličtině:
protein aggregation, alpha-Synuclein, fluorescent probes, inhibitors, protein tags
Abstrakt:
Abstrakt Alfa-synuklein (AS) je malý, vnitřně neuspořádaný protein exprimovaný v neuronech a hojně přítomný v synapsích, kde se podílí na regulaci transportu proteinů zprostředkovaném synaptickými vezikuly. Chybné poskládání AS do amyloidních fibril je klíčovým procesem v progresi Parkinsonovy choroby (PD), druhé nejběžnější neurodegenerativní nemoci, která je dosud neléčitelná. Inhibice agregace AS a blokování šíření těchto fibril z buňky do buňky je slibná strategie pro léčbu PD. Racionální design těchto inhibitorů však zůstává komplikovaný vzhledem k nedostatku detailních znalostí o mechanismech agregace. Cílem této práce bylo proto získat hlubší znalosti o agregaci AS a aplikovat je na vývoj inhibitorů fibrilizace. Při studiu mechanismů agregace AS jsem nejprve zjistila, že kritická koncentrace AS pro růst fibril je o řád nižší než kritická koncentrace AS pro počáteční tvorbu fibril z monomerů. Zkoumala jsem rozpad fibril při koncentracích nižších než Kd a charakterizovala jsem agregaci AS při mikromolárních koncentracích. Poté jsem zkoumala, jak různé modifikace C-terminálu AS (zejména extenze o různé velikosti a náboji) ovlivňují růst fibril a ukázala jsem, že fúze AS s proteiny, jako je GFP, potlačují agregaci AS. Na základě těchto zjištění jsem ve spolupráci s kolegy vytvořila první racionálně navržený inhibitor, který blokuje růstová centra fibril AS. Jedná se o chimérický protein obsahující AS a globulární protein, který se váže na konec fibrily a vytváří stérickou překážku pro následnou vazbu monomeru. Dokázali jsme, že ten inhibitor cílící na růstová centra fibril, která jsou mnohem méně hojná ve srovnání s monomerem AS, je účinný při velmi nízkých koncentracích. Dále jsme u tohoto typu inhibitorů zkoumali vztah mezi strukturou a účinností a definovali jsme zásadní vlastnosti molekuly inhibitoru pro jeho dobrou funkci. Konkrétně jsme prokázali lineární korelaci mezi účinností inhibitoru a jeho afinitou ke koncům fibril. Kromě toho jsme při hledání dalších způsobů, jak zlepšit účinnost inhibitoru, objevili také silné inhibiční vlastnosti kovalentních dimerů AS. V souhrnu, v této studii jsem zkoumala determinanty agregace AS a společně se svými kolegy jsem vytvořila dosud nejúčinnější inhibitory růstu fibril složených z AS.
Abstract v angličtině:
Abstract α-Synuclein (AS) is a small intrinsically disordered protein expressed in neurons and abundantly present in synapses where it is involved in regulation of synaptic vesicle-mediated protein trafficking. Misfolding of AS into amyloid fibrils is a key process in progression of Parkinson’s disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder which has no cure to date. Inhibition of AS aggregation and blocking of cell-to-cell spreading of AS fibrils is a promising strategy for PD treatment. However, rational design of inhibitors of this type remains complicated due to the lack of thorough knowledge about the mechanisms of aggregation. Therefore, the aim of this thesis was to gain deeper knowledge about AS aggregation and to apply it for developing inhibitors of AS fibrillization. In my work on the mechanisms of AS aggregation, I first determined that the concentration of AS that enables the fibril growth is an order of magnitude lower than the concentration of AS required for initial fibril formation from monomers. I explored fibril disaggregation at AS concentrations below its Kd value, and characterized AS aggregation at low micromolar concentrations. I then investigated how different modifications of AS C-terminus (namely, extensions of various sizes and charges) affect fibril growth and demonstrated that fusions of AS with proteins such as GFP suppress AS aggregation. Based on these findings, together with my colleagues I created the first rationally designed inhibitor that blocks AS fibril growth centres. It is a chimeric protein containing AS and a globular protein that binds to the fibril end and creates steric hindrance to subsequent monomer binding. We showed that this inhibitor targeting fibril growing centres, which are much less abundant compared to AS monomers, is efficient at very low concentrations. Furthermore, we explored the structure-activity relationship of inhibitors of this type and defined the properties of inhibitor molecules that are crucial for good inhibitory activity. Namely, we demonstrated a linear correlation between inhibitor activity and its affinity to the fibril ends. Moreover, in a search of further ways to improve the inhibitor’s activity, we also discovered potent inhibition properties of covalent dimers of AS. To sum up, in this study I investigated determinants of AS aggregation and together with my colleagues I created the most efficient inhibitors of AS fibril growth known to date.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Kseniia Afitska, Ph.D. 2.62 MB
Stáhnout Příloha k práci Kseniia Afitska, Ph.D. 14.07 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Kseniia Afitska, Ph.D. 125 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Kseniia Afitska, Ph.D. 124 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Kseniia Afitska, Ph.D. 1.68 MB
Stáhnout Posudek oponenta Doc., Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D. 223 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D. 163 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Miroslav Šulc, Ph.D. 154 kB