velikost textu

Determination of proteinogenic amino acids by high-performance separation techniques

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Determination of proteinogenic amino acids by high-performance separation techniques
Název v češtině:
Stanovení proteinogenních aminokyselin vysokoúčinnými separačními technikami
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Ondřej Hodek
Školitel:
RNDr. Tomáš Křížek, Ph.D.
Oponenti:
prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc.
Doc. RNDr.Ing. Petr Tůma, PhD.
Konzultant:
Mgr. Petr Kozlík
Id práce:
169538
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra analytické chemie (31-230)
Program studia:
Analytická chemie (P1403)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
20. 6. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
kapilární elektroforéza, vodivostní detekce, superkritická fluidní chromatografie, hmotnostní spektrometrie, aminokyseliny
Klíčová slova v angličtině:
capillary electrophoresis, conductivity detection, supercritical fluid chromatography, mass spectrometry, amino acids
Abstrakt:
ABSTRAKT (CZ) Proteinogenní aminokyseliny patří mezi základní stavební jednotky živých organismů. Proto byl v poslední době výzkum v metabolomice zaměřen na vývoj rychlých a citlivých analytických metod pro stanovení aminokyselin. Tato práce obsahuje dvě studie popisující vývoj vysoce účinných separačních metod pro kvantifikaci aminokyselin. V první studii byla vyvinuta metoda kapilární elektroforézy pro stanovení aminokyselin v rostlinách tabáku. Nedílnou součástí této studie byla optimalizace extrakce aminokyselin z rostlinného materiálu. Extrakce byla optimalizována postupem “design of experiments” (DoE), pomocí kterého byly vyhodnoceny faktory ovlivňující výtěžek extrakce aminokyselin. Nejdůležitějšími faktory byly objem a koncentrace extrakčního činidla (kyselina chlorovodíková), jejichž optimální hodnoty byly určeny pomocí “response surface methodology” (RSM). Poté byly aminokyseliny separovány pomocí kapilární elektroforézy s bezkontaktní vodivostní detekcí a stanoveny za použití kalibrace s vnitřním standardem, což přispělo ke zlepšení přesnosti metody. Druhá studie byla zaměřena na vývoj metody pro stanovení aminokyselin v lidské plasmě pomocí superkritické fluidní chromatografie. Jedním z cílů této studie bylo zvýšit rozpustnost aminokyselin v mobilní fázi bohaté na CO2. Nejdříve byla zvýšena polarita mobilní faze (CO2/methanol) přídavkem vody a mravenčanu amonného. Polarita aminokyselin byla zároveň snížena derivatizací 1-chlorbutanem. Derivatizace zvýšila rozpustnost aminokyselin v mobilní fázi, proto se zlepšily tvary píků aminokyselin. Aminokyseliny byly separovány pomocí superkritické fluidní chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí. Stanovení aminokyselin v lidské plasmě bylo provedeno pomocí kalibrace s deuterovanými standardy aminokyselin. V této práci byly obě metody porovnány z hlediska jejich separační účinnosti, mezí stanovitelnosti a provozních nákladů. Použití kapilární elektroforézy pro stanovení aminokyselin zajistilo lepší separační účinnost. Avšak použití superkritické fluidní chromatografie umožnilo stanovení až o pět řádů nižších koncentrací aminokyselin, navíc byla tato metoda podstatně rychlejší. Využití superkritické fluidní chromatografie s tandemovou hmotnostní detekcí ovšem klade vyšší nároky nejen na zkušenosti operátora, ale i na stabilní laboratorní prostředí. Superkritická fluidní chromatografie také vyžaduje vyšší pořizovací a provozní náklady než kapilární elektroforéza.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT (EN) Proteinogenic amino acids are key components of living organisms. Thus, the latest metabolomics research has focused on developing fast and sensitive methods for the determination of amino acids. In this context, this thesis contains two studies describing development of high-performance separation techniques for the quantification of amino acids. In the first study, a capillary electrophoresis method was developed for the determination of free amino acids in tobacco plants, particularly focusing on optimizing the extraction of amino acids from solid plant materials. The extraction procedure was optimized using design of experiments (DoE) to obtain the highest possible extraction yield of amino acids. Factors such as volume and concentration of the extraction solvent (hydrochloric acid) were assessed as the most significant. Subsequently, the optimal values of these factors were determined using response surface methodology (RSM). Lastly, proteinogenic amino acids were quantified using capillary electrophoresis with contactless conductivity detection and calibration with internal standard, which improved the precision of the method. The second study aimed at developing a supercritical fluid chromatography method for the determination of free proteinogenic amino acids in human plasma. The most important part of this study was to improve the solubility of proteinogenic amino acids in a CO2-rich mobile phase. Firstly, the polarity of mobile phase was increased by adding water and ammonium formate to the CO2/methanol mixture. Secondly, the polarity of amino acids was decreased by derivatization with 1-chlorobutane. The derivatization step greatly enhanced the solubility of amino acids in the mobile phase, thus substantially improving the shapes of the amino acid peaks. Proteinogenic amino acids were quantified using tandem mass spectrometry detection and a calibration curve with deuterated internal standards, which provided an acceptable method precision. In this thesis, both methods were compared, focusing on separation efficiency, limits of quantification, and acquisition and operating costs. This comparison showed that the separation efficiency was better in capillary electrophoresis method than in supercritical fluid chromatography. On one hand, the latter was faster than the former and enabled the quantification of concentrations up to five orders of magnitude lower. On the other hand, operation of a supercritical fluid chromatography with tandem mass spectrometry not only requires more qualified operators but also more stable laboratory conditions and higher acquisition and operating costs.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Ondřej Hodek 2.64 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Ondřej Hodek 60 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Ondřej Hodek 12 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Ondřej Hodek 203 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. RNDr. Věra Pacáková, CSc. 175 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. RNDr.Ing. Petr Tůma, PhD. 153 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.15 MB