velikost textu

Využití masivně paralelního sekvenování nové generace pro diagnostiku hereditární spastické paraparézy: Příspěvek k rozvoji DNA diagnostiky vysoce heterogenního onemocnění

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Využití masivně paralelního sekvenování nové generace pro diagnostiku hereditární spastické paraparézy: Příspěvek k rozvoji DNA diagnostiky vysoce heterogenního onemocnění
Název v angličtině:
The Application of Massively Parallel Next Generation Sequencing Technologies for Diagnosis of Hereditary Spastic Paraplegia: A Contribution to the Development of DNA Diagnosis of a Highly Heterogeneous Disease
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Anna Uhrová Mészárosová
Školitel:
Prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
Oponenti:
Doc. MUDr. Jan Roth, CSc.
Mgr. Mária Janíková, Ph.D.
Konzultant:
MUDr. Dana Šafka Brožková, Ph.D.
Id práce:
163965
Fakulta:
2. lékařská fakulta (2.LF)
Pracoviště:
Klinika dětské neurologie (13-441)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
12. 9. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Dizertační práce RNDr. Anna Uhrová Mészárosová Využití masivně paralelního sekvenování nové generace pro diagnostiku hereditární spastické paraparézy Příspěvek k rozvoji DNA diagnostiky vysoce heterogenního onemocnění Školitel: prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D. Konzultantka: MUDr. Dana Šafka Brožková, Ph.D. Praha, 2018 Souhrn Předkládaná dizertační práce zpracovává výsledky molekulárně genetických vyšetření českých pacientů onemocněním hereditární spastická paraplegie a mapováním genetického pozadí této nemoci u českých pacientů. Hereditární spastická (HSP) je dědičné neurologické onemocnění se všemi typy mendelovské dědičnosti, které se projevuje bilaterální progresivní spasticitou a slabostí dolních končetin a vede k postupně se zhoršující chůzi, u některých pacientů může dojít až k úplné ztrátě schopnosti samostatné chůze. HSP je onemocnění velice heterogenní jak klinicky, tak geneticky. Bylo popsáno přes 90 typů nemoci a přes 70 genů, jejichž patogenní varianty mohou způsobovat tuto nemoc. Onemocnění se většinou projevuje jako tzv. nekomplikovaný typ nemoci, vyskytují se ale i formy komplikované s přidruženými příznaky (mentální retardace, epilepsie, ataxie, atrofie optického nervu, aj.) U souboru 96 českých pacientů s klinickým podezřením na nekomplikovanou HSP, u nichž byl předem vyloučen nejčastější typ nemoci SPG4, bylo provedeno masivně paralelní sekvenování panelu genů spojených a popsaných s nekomplikovanou HSP. Za použití kitu HaloPlex Target Enrichment nebo SureSelect Target Enrichment (Agilent Technologies, US) s vlastními navrženými probami byl sekvenovány všechny kódující oblasti plus přilehlé intronové oblasti vybraných genů a to ve 3 verzích panelu, vždy aktualizovaných o nově popsané geny. U čtyř pacientů bylo provedeno celoexomové sekvenování (WES) pomocí kitu SureSelect All Exon Kit v6 (Agilent Technologies, US). Nalezené varianty byly ověřeny Sangerovým sekvenováním a jejich patogenita/kauzalita byla hodnocena in silico a tam, kde to bylo možné, pomocí segregační analýzy v rodině. Z 96 pacientů vyšetřených pomocí NGS sekvenování panelu genů byla kauzální varianta nalezena u 22 pacientů, což představuje objasněnost 23 % (22 z 96). Ve skupině familiárních pacientů byla objasněnost vyšší 29,4 % (15 z 51) než ve skupině sporadických pacientů s objasněností u 15,5 % (7 ze 45). Ze čtyř pacientů vyšetřených pomocí WES byli objasněni dva. Celkem jsme pomocí MPS / NGS technik diagnostikovali a objasnili 10 různých typů HSP mezi českými non-SPG4 pacienty (SPG4, SPG5, SPG6, SPG7, SPG10, SPG11, SPG31, PSG35, SPG77 a IAHSP, nebyl diagnostikován ani jeden pacient s SPG3). Nejčastější typ je SPG31 s kauzálními variantami v genu REEP1, tento typ je též nejčastější i mezi autozomálně dominantně děděnými typy HSP. Mezi autozomálně recesivními typy je nejčastější SPG11 (s mírnou převahou) a SPG7. Mezi českými pacienty jsme zjistili velmi nízký výskyt SPG3 (kauzální varianty v genu ATL1), který byl uváděn jako druhý nejčastější typ nemoci a nejčastější u pacientů s časným nástupem nemoci. Ve skupině vyšetřených pacientů byly nalezeny i vzácné typy nemoci: SPG35 (gen FA2H) a zejména SPG77 (gen FARS2), kdy je český pacient teprve třetí celosvětově s tímto typem nemoci. Bylo nalezeno 12 nových variant v celkem 6 genech, nejvíce nových variant je v genu REEP1. Spojením a sumarizací těchto výsledků se souborem již dříve objasněných SPG4 a SPG3 pacientů jsme zjistili celkové genetické spektrum HSP u českých pacientů. V české populaci tak bylo prozatím nalezeno 11 typů HSP (10 typů z NGS plus SPG3 z předchozích vyšetření) s převahou SPG4 u téměř 70 % objasněných pacientů. Častěji se dále vyskytují typy SPG31, SPG11, SPG7 a SPG10 u 8,3 %, 6,0 %, 4,8 % a 3,6 % objasněných pacientů. Tyto výsledky ukazují a potvrzují, že vyšetření jednoho samostatného genu, kromě SPAST (pro SPG4) (ani ATL1 pro SPG3) není příliš efektivní a je vhodné po vyšetření SPG4 pokračovat v indikovaných případech vyšetřením panelu genu pomocí MPS/NGS. Malá velikost genu REEP1 (jen 6 exonů) může být důvodem k vyšetření u vybraných pacientů místo dosud často indikovaného genu ATL1 (13 exonů) s mnohem menší šancí na objasnění. Tato dizertační práce představuje první publikované podrobné výsledky o epidemiologii HSP a genetickém pozadí této nemoci v ČR a jde tedy o unikátní data.
Abstract v angličtině:
Doctoral thesis Anna Uhrová Mészárosová, MSc. The Application of Massively Parallel Next Generation Sequencing Technologies for Diagnosis of Hereditary Spastic Paraplegia: A Contribution to the Development of DNA Diagnosis of a Highly Heterogeneous Disease. Prague, 2018 Abstract The aim of this work is to map the genetical spectrum of hereditary spastic paraplegia in Czech patients. Hereditary spastic paraplegia (HSP) is an inherited neurological disorder, clinically characterized by progressive weakness and spasticity of the lower limbs leading to problems with gait and can cause the complete loss of the ability to walk. HSP is clinically and genetically very heterogenous; more than 90 HSP types and pathogenic variants in more than 70 genes have been described to date. HSP manifests as an uncomplicated (pure) form in the majority of HSP patients. Less often it manifests as a complicated phenotype with the associated clinical signs (mental impairment, epilepsy, ataxia, atrophy of the optic nerve). We performed massively parallel sequencing (MPS) of uncomplicated HSP gene panel in a group of 96 Czech patients with suspected uncomplicated type of HSP. In all patients the most common HSP type SPG4 was previously excluded. HaloPlex Target Enrichment kit and SureSelect Target Enrichment kit (both Agilent Technologies, US) with custom probes designed was used for MPS. All coding and neighbouring regions of included genes was sequenced by MPS. We performed whole exome sequencing (WES) in four patients using SureSelect All Exon Kit v6 (Agilent Technologies, US). The presence of all found variants was confirmed by Sanger sequencing. Their pathogenicity was assessed in silico and by segregation analysis where possible. The causal pathogenic variant was found in 22 patients from 96 examined using MPS sequencing of the gene panel. Our results represent 23 % of examined patients evaluated by this method (22 from 96). The percentage of evaluated patients was 29,4 % in the group of familial patients (15 from 55) and it was higher than in the group of sporadic patients with 15,5 % evaluated patients (7 from 45). Two patients were evaluated by WES from four patients examined. By using next generation sequencing methods (MPS of gene panel and WES) we found all together 10 types of HSP among the non-SPG4 Czech patients (SPG4, SPG5, SPG6, SPG7, SPG10, SPG11, SPG31, PSG35, SPG77 a IAHSP, no patient with SPG3 was diagnosed); the most frequent is type SPG31 with pathogenic variants in the REEP1 gene. SPG31 is the most frequent type among the autosomal dominant HSPs. The most frequent autosomal recessive type of HSP are SPG11 (slightly more frequent) and SPG7. We observe a low frequency of SPG3 (variants in ATL1 gene) among the Czech HSP patients although this type was repeatedly described as the second most frequent type of HSP. We found rare types of HSP, such as SPG35, IAHSP and especially SPG77. The Czech patient with SPG77 is the fourth patient worldwide. Twelve new variants in six genes together have been found. The number of new variants is highest in the REEP1 gene. In the more frequent types of HSP diagnosed it this work we discuss the phenotypic features characteristic for types of HSP. These data can be useful for further clinical diagnostics. We summarized the results from this work and the group of previously evaluated patients with SPG4 and SPG3, which allows us to describe the genetical characteristics of the group of Czech HSP patients. Altogether 11 types of HSP have been found among Czech patients with hereditary spastic paraplegia to date (with SPG3 diagnosed previously). The most frequent type is SPG4 (70 % of all evaluated HSP patients). The other more frequent types are SPG31, SPG11, SPG7 and SPG10 in 8.3 %, 6.0 %, 4.8 % and 3.6 % from all evaluated patients. Sanger sequencing is effective only in SPAST gene, sequencing of REEP1 gene can be more effective than sequencing of ATL1 gene. All these results represent the very first data concerning the genetic characteristics of hereditary spastic paraplegia in the Czech Republic and are thus unique with regard to epidemiological data about diagnosis HSP.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Anna Uhrová Mészárosová 4.33 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Anna Uhrová Mészárosová 137 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Anna Uhrová Mészárosová 60 kB
Stáhnout Posudek oponenta Doc. MUDr. Jan Roth, CSc. 1.74 MB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Mária Janíková, Ph.D. 183 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 458 kB