velikost textu

Differentiation plasticity of hematopoietic cells

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Differentiation plasticity of hematopoietic cells
Název v češtině:
Diferenciační plasticita hematopoetických buněk
Typ:
Disertační práce
Autor:
MUDr. Kamila Polgárová, Ph.D.
Školitel:
doc. MUDr. Tomáš Stopka, Ph.D.
Oponenti:
MUDr. Pavel Otáhal, PhD.
MUDr. Mgr. Cyril Šálek, Ph.D.
Konzultant:
doc. MUDr. Ondřej Hrušák, Ph.D.
Id práce:
163387
Fakulta:
2. lékařská fakulta (2.LF)
Pracoviště:
Ostatní pracoviště (13-999)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
16. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
krvetvorba, regulace diferenciace, liniový přesmyk, akutní leukémie, myelodysplastický syndrom, rezistence na azacitidin
Klíčová slova v angličtině:
hematopoiesis, cell fate regulation, lineage switch, acute leukemia, myelodysplastic syndrome, azacitidine resistance
Abstrakt:
Hematopoéza byla mnoho let považována za nezvratný přímočarý proces, který postupným omezováním liniové plasticity vedl k vzniku zralých krevních elementů. V posledních letech se však objevily práce, které poukazují na nečekaně široký potenciál hematopoetických buněk, kdy i z lymfoidních prekurzorů můžou vzniknout zralé myeloidní buňky a naopak. Za fyziologických okolností je krvetvorba striktně regulována a definitivní osud buněk je ovlivněn mnoha faktory, které vedou ke změnám regulačních sítí zahrnujících transkripční faktory, epigenetické či post-transkripční modulátory. Jakékoli narušení této přísné kontroly, způsobené mutacemi nebo jinými událostmi, ovlivňuje proliferaci a liniovou plasticitu hematopoetických prekurzorů. To může vést ke klonálnímu růstu rozličné signifikance či k leukemogenezi. Změny v jednotlivých dráhách pak mohou ovlivnit i citlivost hematologických malignit na léčbu. Pro lepší pochopení hematopoetické regulace jsme se rozhodli popsat změny genové exprese v průběhu fyziologického vývoje zdravých lymfoidních a myeloidních buněk, jakož i u buněk leukemických a to pomocí vlastní zjednodušené platformy založené na PCR v reálném čase. V sortovaných hematopoetických progenitorech a jejich maligních protějšcích jsme vyšetřili expresi 95 genů spojených s diferenciací vybraných leukocytárních populací nebo s leukemogenezí. Také jsme zkoumali změny exprese v jednotlivých subpopulacích nově popsané skupiny dětské ALL – leukémie s liniovým přesmykem. Tuto specifickou skupinu jsme dále popsali za použití průtokové cytometrie, detekce Ig/TCR přestaveb, cytogenetických a mutačních analýz a vyšetření metylačního statusu promotoru CEPBA. Nakonec jsme pomocí sekvenování nové generace vyhodnotili mutace v další jednotce ze širokého spektra hematologických malignit – MDS s vysokým rizikem. Opakované odběry vzorků před a během hypometylační léčby azacitidinem nám umožnily vyhodnotit dynamiku mutací v průběhu onemocnění. V průběhu vývoje jednotlivých linií jsme pozorovali vyšší expresi různých genů. Například PAX5, FOXO1, TCF3, BCL11A a další byly více exprimovány v průběhu vývoje B-lymfocytů, zatímco BCL11B, TCF7, HOXB4, NOTCH3 byly upregulovány v T-buněčném vývoji; během myeloidního vývoje jsme vedle jiných detekovali vyšší expresi genů z CEBP rodiny, ID2, KLF4 nebo MNDA. Mezi zdravými a maligními populacemi bylo také pozorováno několik významných rozdílů. Vedle očekávané upregulace genů z rodiny HOX či genu FLT3 byl nejvýraznější kontrast zjištěn v úrovni exprese CCDC26 a PAWR, u nichž se předpokládá vliv na léčebnou odpověď u pacientů s ALL. Dále jsme popsali fenomén liniového přesmyku u ALL, který se většinou vyskytuje ve dnech 1 až 33 indukční terapie. U všech pacientů s tímto typem leukémie byla v čase diagnózy detekována membránová exprese CD2, kdežto u pacientů bez liniového přesmyku byla CD2 pozitivita zachycena pouze vzácně. Monocytoidní populace vzniknuvší po liniovém přesmyku vykazovala stejný imunofenotyp i mRNA expresní profil jako normální monocyty od zdravých dárců. V této monocytoidní populaci však byly zjištěny přestavby imunoglobulinů specifické pro danou leukémii, což potvrzuje její leukemický původ. Expresní profilování poukázalo na CEBPA jako možný klíčový regulátor transdiferenciace, což dále podpořil průkaz hypometylace CEBPA promotoru. V naší kohortě nebyla zjištěna žádná další společná molekulární ani cytogenetická změna. Všechna uvedená expresní data ze zdravých i leukemických vzorků jsou dostupná ve veřejné databázi LeukoStage.org. Nakonec jsme popsali dynamiku mutací u pacientů s MDS během hypometylační léčby a identifikovali několik možností vývoje, které korelují s průběhem onemocnění. Objevili jsme mutace ovlivňující citlivost na azacitidin či přímo selektované terapií. Analýzou sekvenčně odebraných vzorků jsme byli schopni předvídat i blížící se klinický relaps onemocnění.
Abstract v angličtině:
Hematopoiesis has been for many years seen as a straightforward process based on sequential restriction of cell fate potential leading to production of mature blood cells. In the last decade, however, several works documented an unexpected plasticity of hematopoietic cells with expanded potential of myeloid development from lymphoid progenitors and vice versa. Under physiologic conditions hematopoiesis is tightly controlled and the definite cell fate is denominated by multiple factors that all lead to changes in regulatory networks that include transcription factors, epigenetic changes and post-transcriptional modulations. Any disruption of this strict regulation, caused by mutations or other events, affects the proliferation and lineage fidelity of hematopoietic precursors. This may lead to clonal growth of variable significance or leukemogenesis and may possibly affect the treatment sensitivity of the hematological malignancies. For better understanding of hematopoietic regulation we described gene expression changes during physiological development of lymphoid and myeloid lineages and in leukemic specimens using our own simplified real-time PCR based platform. We investigated expression of 95 genes connected with lymphoid and myeloid differentiation or with leukemogenesis in sorted hematopoietic progenitors and their malignant counterparts. We also investigated the expression changes in separate subpopulations of the newly described subset of childhood ALL - lineage switching leukemia and confronted them with observations in nonmalignant populations. Further, using flow cytometry, Ig/TCR rearrangements detection, cytogenetics and mutation studies and methylation status of CEPBA promoter we described this specific subset within its molecular context including phenotypic and genotypic peculiarities or epigenetic changes. Finally, using massively parallel sequencing we evaluated mutations in another unit from the spectrum of hematological malignancies - high risk MDS. Using sequential sampling before and during hypomethylation treatment with azacitidine we were able to evaluate mutations dynamics within the disease course. We identified several lineage associated genes being upregulated during particular population development. PAX5, FOXO1, TCF3, BCL11A and others were upregulated during B-lymphocytes evolution whereas BCL11B, TCF7, HOXB4, NOTCH3 are examples of T-cell fate regulators; besides others CEBP family, ID2, KLF4 or MNDA were detected during myeloid maturation. Several significant differences were also observed between healthy and malignant populations. Besides the expected HOX family or FLT3, the most striking contrast was detected in expression levels of CCDC26 and PAWR, which both correlate with therapy response in patients with ALL. We further described a rare phenomenon of lineage switch in ALL that mostly occurs within days 1 to 33 of induction regimen. All switching samples were CD2pos at time of diagnosis, which was not true for non-switching leukemias. After the switch, the formed monocytoid population presented with the same phenotype and mRNA expression profile as normal monocytes from healthy controls. However, leukemia specific immunoglobulin rearrangements were detected in this population proving its leukemic provenience. Our expression platform depicted CEBPA as a possible key regulator of the lineage switch, which was further supported by the finding of hypomethylation of CEBPA promoter. No other common molecular or cytogenetic markers were identified in our cohort. Using the above mentioned mRNA expression data from healthy and leukemic specimens we prepared publicly available LeukoStage.org database. Finally, we described mutation architecture dynamics in MDS patients during hypomethylation treatment and identified several dynamics patterns correlating with the disease course. We were able to depict mutations that preclude resistance to the demethylation therapy or those selected by the treatment. We were also able to predict ongoing clinical relapse.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce MUDr. Kamila Polgárová, Ph.D. 7.42 MB
Stáhnout Příloha k práci MUDr. Kamila Polgárová, Ph.D. 196 kB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce MUDr. Kamila Polgárová, Ph.D. 195 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky MUDr. Kamila Polgárová, Ph.D. 128 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Pavel Otáhal, PhD. 127 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Mgr. Cyril Šálek, Ph.D. 1.97 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 6 MB