velikost textu

Molecular basis of clonal heterogeneity of hematological diseases

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular basis of clonal heterogeneity of hematological diseases
Název v češtině:
Molekulární základy klonální heterogenity hematologických onemocnění
Typ:
Disertační práce
Autor:
Oľga Babošová, Ph.D.
Školitel:
Ing. Lucie Láníková, Ph.D.
Oponenti:
Meritxell Alberich-Jorda, M.Sc., Ph.D.
Mgr. Monika Horváthová, Ph.D.
Id práce:
156703
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Vývojová a buněčná biologie (P1529)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
5. 2. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
JAK2, lymfóm z plášťových buniek, myeloproliferatívne nádory
Klíčová slova v angličtině:
JAK2, Mantle cell lymphoma, myeloproliferative neoplasms
Abstrakt:
Abstrakt Nádorová heterogenita bola rozoznávaná už desiatky rokov. Predmetom tejto práce sú molekulárne mechanizmy ovplyvňujúce klonálnu heterogenitu hematologických ochorení, konkrétne myeloproliferatívnych neoplázií (MPN) a lymfómov z plášťových buniek so zameraním sa na niekoľko zdedených genetických faktorov, zápal, obranné mechanizmy poškodenia DNA (DDR) v procese leukemickej transformácie a liečebné stratégie. V prvom rade sa venujem štúdiu dedičných mutácií v géne JAK2, ako tieto mutácie ovplyvňujú iniciáciu a progresiu MPN ochorení a ako môžu prispievať k ďalším genómovým zmenám v mutovanom klone. V štúdii, ktorú vykonalo naše spolupracujúce laboratórium v Utahu v USA1, analyzovali mutačné rozpätie 31 pacientov s JAK2 V617F-pozitívnym polycytémia vera ochorením. Identifikovali dve nové dedičné mutácie v géne JAK2, JAK2 T108A a JAK2 L393V. Ďalšia štúdia2, ktorú vykonalo naše spolupracujúce laboratórium v Olomouci, charakterizovala dve zdedené mutácie JAK2, E846D a R1063H, v prípade dedičnej erytrocytózy sprevádzanej megakaryocytárnou atypiou. Mutácia JAK2 R1063H bola spočiatku opísaná u 3 z 93 pacientov polycytémie vera, ktoré boli JAK2 V617F-pozitívne.3 Naším cieľom bolo identifikovať úlohu vybraných zdedených mutácií v géne JAK2 pri iniciácii a progresii MPN ochorení. Ukazujeme, že mutácie JAK2 T108A a L393V sú slabo aktivujúce, vedú k zvýšenej senzitivite na erytropoetin, ktoré môžu predurčovať bunky nesúce tieto mutácie na zvýšenie rýchlosti rastu (proliferácie) vo fyziologických podmienkach. Preto je možné, že tieto dva varianty môžu predchádzať získaniu mutácie JAK2 V617F v priebehu ochorenia a prispievať k ďalším genómovým zmenám v mutovanom klone a prípadne aj k leukemickej transformácii. Ďalej sme charakterizovali dvojitý mutant JAK2 V617F/R1063H v kohorte MPN pacientov z Belgicka a Rumunska. Ukázalo sa, že obe mutácie spolupracujú na zvyšovaní signalizácie JAK-STAT charakteristickej pre mutant JAK2 V617F. MPN pacienti s týmito dvoma mutáciami maju zvýšené množstvo bielych krviniek a následne zvýšené množstvo neutrofilov, čo by mohlo byť dôsledkom zvýšenej biochemickej asociácie mutantu JAK2 R1063H s receptorom faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (G- CSFR). V druhom rade sa sústredim na charakterizovanie ochrannej úlohy proteínu KAP1 v progresii MPN ochorení. Predpokladáme, že podobný proces aktivácie komponentov DRR, ako je opísaný v pevných nádoroch, sprevádza priebeh MPN a že aktivácia nádorovej supresorovej bariéry pôsobí proti progresii akútnej leukémie. Na charakterizáciu úlohy proteínu KAP1 v DDR u buniek pozitívnych na JAK2 V617F sme vytvorili HEL (ľudská erytroleukémia, JAK2 V617F-pozitívne) bunkovú líniu nesúcu alelu JAK2 WT a následne sme v týchto bunkách vyradili gén KAP1. KAP1 bude ďalej študovaný v tomto settingu, bude skúmaná jeho úloha v proliferácii buniek pri indukovanom poškodení DNA, diferenciácia a jeho vplyv na genómovú nestabilitu. V treťom rade sa sústredím na identifikáciu úlohy prolylhydroxylázy 1 (EGLN2/PHD1) a transkripčného faktora FOXO3A v lymfóme z plášťových buniek (mantle cell lymphoma, MCL). Bol popisané4, že neschopnosť PHD1 hydroxylovať FOXO3A podporuje jeho akumuláciu v bunkách, čo následne potláča expresiu cyklínu D1 ešte neznámym mechanizmom. Cyklín D1 je nadmerne exprimovaný v MCL a preto je zaujímavé, či by chelácia železa, ktorá inhibuje funkciu PHD1, bola prospešná pri downregulácii cyklínu D1 v bunkách MCL. Ukázalo sa, že chelácia železa vedie k zníženiu hladiny mRNA a proteínov cyklínu D1 v bunkových líniách MCL5, molekulárny mechanizmus však zostáva neznámy. Chelácia železa bola predtým popísaná v proteázovej degradácii cyklínu D1 mechanizmom nezávislým od ubikvitínu.6 V našej štúdii sme ukázali, že v bunkových líniách MCL je chelatácia železa účinná pri inhibícii proliferácie, indukcii apoptózy a zastavenia bunkového cyklu pomocou regulácie cyklínu D1. Ukazuje sa tiež, že nadmerná expresia cyklínu D1 v týchto bunkách spôsobuje, že sú náchylnejšie na chelatáciu. Zistili sme, že cyklín D1 v bunkách MCL uniká regulačnému okruhu PHD1 - FOXO3A a downregulácia cyklínu D1 pri deplecii železa je regulovaná iným neznámym mechanizmom. Ďalej sme skúmali úlohu NQO1 (o ktorom sa preukázalo, že sa podieľa na proteazomálnej degradácii nezávislej od ubikvitínu) použitím inhibítora NQO1 dicumarolu, aby sa zistilo, či jeho nedostupnosť môže viesť k destabilizácii proteínu cyklínu D1 v bunkových líniách MCL. Bunky ošetrené DIC vykazovali zníženie hladín mRNA a proteínu cyklínu D1. Nie je jasné, či sledovaná represia cyklínu D1 je výsledkom NQO1, ktorý má špecifickú ochrannú úlohu pri degradácii proteínov alebo je výsledkom nešpecifickej inhibície jeho oxidoredukčnej aktivity. 1. Wang L, Swierczek SI, Drummond J, et al. Whole-exome sequencing of polycythemia vera revealed novel driver genes and somatic mutation shared by T cells and granulocytes. Leukemia. 2014;28(4):935–938. 2. Kapralova K, Horvathova M, Pecquet C, et al. Cooperation of germ line JAK2 mutations E846D and R1063H in hereditary erythrocytosis with megakaryocytic atypia. Blood. 2016;128(10):1418–23. 3. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005;7(4):387–397. 4. Zhang Q, Gu J, Li L, et al. Control of Cyclin D1 and Breast Tumorigenesis by the EglN2 Prolyl Hydroxylase. Cancer Cell. 2009;16(5):413–424. 5. Vazana-Barad L, Granot G, Mor-Tzuntz R, et al. Mechanism of the antitumoral activity of deferasirox, an iron chelation agent, on mantle cell lymphoma. Leuk. Lymphoma. 2013;54(4):851–9. 6. Nurtjahja-Tjendraputra E, Fu D, Phang JM, Richardson DR. Iron chelation regulates cyclin D1 expression via the proteasome: a link to iron deficiency-mediated growth suppression. Blood. 2007;109(9):4045–54.
Abstract v angličtině:
Abstract Tumor heterogeneity has been recognized for decades. The molecular mechanisms impacting clonal heterogeneity in hematological diseases, specifically myeloproliferative neoplasms (MPN) and mantle cell lymphoma, with the focus on several inherited genetic factors, inflammation, the protective mechanisms of DNA damage response (DDR) in the leukemic transformation and the treatment strategies are the focus of this thesis. Firstly, I focus on studying germline JAK2 variants and how these may influence the initiation and progression of MPN diseases, and even contribute to further genomic alterations in the mutated clone. A study performed by our cooperating lab in Utah, USA,1 analyzing the mutational landscape of 31 JAK2 V617F-positive polycythemia vera (PV) patients identified two novel germline mutations in JAK2 gene, JAK2 T108A and JAK2 L393V. Another study2, performed by our cooperating lab in Olomouc, Czech Republic, characterized two germline JAK2 mutations, E846D and R1063H, in a case of hereditary erythrocytosis accompanied by megakaryocytic atypia. The JAK2 R1063H variant was initially described in 3 out of 93 PV patients that were JAK2 V617F-positive.3 Our aim was to identify the role of selected inherited mutations in JAK2 gene in the initiation and progression of myeloproliferative neoplasms. We show that the mutations JAK2 T108A and L393V are weakly activating, they give rise to a kinase hypersensitive to erythropoietin, which could predispose cells carrying these mutations to proliferate at higher rate in physiological conditions. It is therefore possible that these two variants could precede the acquisition of JAK2 V617F mutation in the course of the disease and contribute to further genomic alterations in the mutated clone and perhaps even leukemic transformation. We further characterized the double mutant JAK2 V617F/R1063H in a cohort of MPN patients from Belgium and Romania. The two mutations are shown to cooperate to further increase JAK-STAT signaling characteristic of the single mutant JAK2 V617F. MPN patients with these two mutations present with higher amounts of white blood cells, and consequently higher amounts of neutrophils, which could be linked to increased biochemical association of the JAK2 R1063H mutant to granulocyte colony-stimulating factor receptor (G-CSFR). Secondly, I focus on deciphering the protective role of KAP1 protein in the progression of myeloproliferative neoplasms. We hypothesize that a similar process of activating DRR components as described in solid tumors underlines the course of MPNs and that the activation of a tumor suppressor barrier counteracts the progression to acute leukemia. In order to characterize the role of KAP1 protein in DDR of JAK2 V617F-positive cells we generated HEL cell line (human erythroleukemia, JAK2 V617F-positive) carrying either JAK2 WT or JAK2 V617F allele and consequently we knocked-out KAP1 gene in these cells. KAP1 will further be studied in this setting, its role in cell proliferation upon induced DNA damage, differentiation and its impact on genomic instability will be characterized. Thirdly, I focus on identifying the role of prolyl hydroxylase 1 (EGLN2/PHD1) and FOXO3A transcription factor in mantle cell lymphoma (MCL). It has been previously4 reported that an inability of PHD1 to hydroxylate FOXO3A promotes its accumulation in cells, which in turn suppresses cyclin D1 expression by a yet unknown mechanism. Cyclin D1 is overexpressed in MCL and it is therefore of interest whether iron chelation, which inhibits the function of PHD1, would be beneficial in downregulating cyclin D1 in MCL cells. It was indeed shown that iron chelation decreases cyclin D1 mRNA and protein levels in MCL cell lines5, the molecular mechanism, however, remains unknown. Iron chelation has been previously reported to promote cyclin D1 proteasomal degradation by a ubiquitin-independent mechanism.6 In our study we show that in MCL cell lines iron chelation is effective in inhibiting proliferation, inducing apoptosis and cell cycle arrest by means of regulating cyclin D1 levels. We also show that the overexpression of cyclin D1 in these cells makes them more susceptible to chelation treatment. We found out that cyclin D1 in MCL cells escapes PHD1 – FOXO3A regulation circuit and cyclin D1 downregulation upon iron depletion is regulated by a different yet unknown mechanism. We further studied the role of NQO1, previously shown to be involved in ubiquitin-independent proteasomal degradation, by employing NQO1 inhibitor dicoumarol to determine whether its unavailability could lead to destabilization of cyclin D1 protein in MCL cell lines. DIC-treated cells exhibited downregulation of cyclin D1 mRNA and protein levels. It remains unclear whether the observed cyclin D1 repression is an outcome of NQO1 having a specific protective role in protein degradation or is a result of unspecific inhibition of its oxidoreductase activity. 1. Wang L, Swierczek SI, Drummond J, et al. Whole-exome sequencing of polycythemia vera revealed novel driver genes and somatic mutation shared by T cells and granulocytes. Leukemia. 2014;28(4):935–938. 2. Kapralova K, Horvathova M, Pecquet C, et al. Cooperation of germ line JAK2 mutations E846D and R1063H in hereditary erythrocytosis with megakaryocytic atypia. Blood. 2016;128(10):1418–23. 3. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005;7(4):387–397. 4. Zhang Q, Gu J, Li L, et al. Control of Cyclin D1 and Breast Tumorigenesis by the EglN2 Prolyl Hydroxylase. Cancer Cell. 2009;16(5):413–424. 5. Vazana-Barad L, Granot G, Mor-Tzuntz R, et al. Mechanism of the antitumoral activity of deferasirox, an iron chelation agent, on mantle cell lymphoma. Leuk. Lymphoma. 2013;54(4):851–9. 6. Nurtjahja-Tjendraputra E, Fu D, Phang JM, Richardson DR. Iron chelation regulates cyclin D1 expression via the proteasome: a link to iron deficiency-mediated growth suppression. Blood. 2007;109(9):4045–54.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Oľga Babošová, Ph.D. 5.04 MB
Stáhnout Příloha k práci Oľga Babošová, Ph.D. 3.25 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Oľga Babošová, Ph.D. 473 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Oľga Babošová, Ph.D. 466 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Oľga Babošová, Ph.D. 532 kB
Stáhnout Posudek vedoucího Ing. Lucie Láníková, Ph.D. 479 kB
Stáhnout Posudek oponenta Meritxell Alberich-Jorda, M.Sc., Ph.D. 274 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Monika Horváthová, Ph.D. 5.83 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 122 kB