velikost textu

Antioxidační a protizánětlivé účinky bilirubinu.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Antioxidační a protizánětlivé účinky bilirubinu.
Název v angličtině:
Antioxidant and antiinflammatory effects of bilirubin.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Bc. Petra Valášková
Školitel:
MUDr. Lucie Muchová, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Markéta Martínková, Ph.D.
MUDr. Karel Dvořák, Ph.D.
Id práce:
156066
Fakulta:
1. lékařská fakulta (1.LF)
Pracoviště:
Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN v Praze (11-00410)
Program studia:
Biochemie a patobiochemie (P1412)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
bilirubin, hyperbilirubinémie, zánět, LPS, NF-κB, oxidační stres, LC-MS/MS
Klíčová slova v angličtině:
bilirubin, hyperbilirubinemia, inflammation, LPS, NF-κB, oxidative stress, LC-MS/MS
Abstrakt:
Abstrakt Bilirubin (BR) byl dlouho považován pouze za odpadní molekulu s potenciálně toxickými účinky zejména na centrální nervový systém. Později bylo zjištěno, že BR působí i cytoprotektivně a mírně zvýšené koncentrace BR vykazují antioxidační, protizánětlivé a imunomodulační účinky, nicméně přesné mechanismy jsou stále předmětem intenzivního výzkumu. Hlavním cílem této práce bylo studium protektivních účinků BR na experimentálních in vivo a in vitro modelech ve vztahu k zánětu a oxidačnímu stresu. Dílčím cílem práce bylo zavedení a validace analytické metody pro stanovení BR a lumirubinu. Potkanům kmene Gunn a příslušným normobilirubinemickým kontrolám byl aplikován lipopolysacharid (LPS, 6 mg/ml, i.p.) nebo fyziologický roztok. Po 12 hodinách byla odebrána krev a vybrané orgány na analýzu markerů zánětu a jaterního poškození. Primární hepatocyty izolované z jater experimentálních potkanů byly ovlivněny BR a TNF-α, buněčné linie HepG2 a SH-SY5Y byly ovlivněny BR a kyselinou chenodeoxycholovou. Hyperbilirubinemičtí potkani měli po aplikaci LPS ve srovnání s normobilirubinemickými potkany signifikantně sníženou zánětlivou odpověď a stupeň jaterního poškození. U potkanů kmene Gunn jsme pozorovali odlišný profil podskupin leukocytů a zároveň snížení exprese mRNA a koncentrace cytokinů IL-6, TNF-α, IL-1β a IL-10 ve srovnání s kontrolami. Exprese mRNA LBP (proteinu vázajícího LPS) byla u potkanů Gunn zvýšena před i po aplikaci LPS oproti kontrolám. Zároveň byla aktivita AST a ALT, markerů hepatocelulárního jaterního poškození, významně nižší u potkanů kmene Gunn ve srovnání s kontrolami ovlivněnými LPS. Expozice primárních hepatocytů TNF-α vedla k aktivaci dráhy NF-κB a fosforylaci její podjednotky p65, BR stupeň fosforylace této podjednotky signifikantně snižoval. BR také snižoval oxidační stres vyvolaný kyselinou chenodeoxycholovou in vitro. Metoda LC-MS/MS pro současné stanovení BR a lumirubinu byla lineární až do 400 µmol/1 pro BR a 100 µmol/l pro lumirubin se submikromolárními limity detekce a s parametry platnými pro relevantní použití v klinické chemii. Závěrem lze říci, že hyperbilirubinémie u potkanů kmene Gunn je spojena se sníženým stupněm zánětu a nižším jaterním poškozením po expozici LPS. Současně jsme potvrdili úlohu BR při ochraně buněk před oxidačním stresem vyvolaným kyselinou chenodeoxycholovou. Byla zavedena a validována LC-MS/MS metoda pro současné stanovení BR a lumirubinu. Klíčová slova: bilirubin, hyperbilirubinémie, zánět; LPS; NF-κB, oxidační stres, LC-MS/ MS
Abstract v angličtině:
Abstract For a long time, bilirubin (BR) has been considered a waste molecule with potential toxic effects especially on the central nervous system. Later, it was found that BR exhibited cytoprotective effects and mildly elevated BR levels showed antioxidant, anti-inflammatory and immunomodulatory properties, however, exact mechanisms of the anti-inflammatory actions of BR have not been fully understood yet. The main aim of this study was to assess the protective effects of BR using experimental in vivo and in vitro models in relation to inflammation and oxidative stress. Partial goal was to establish validated analytical method for determination of BR and lumirubin. Gunn and heterozygous rats were treated with lipopolysaccharide (LPS, 6 mg/kg, IP) or vehicle (saline). After 12 hours, blood and organs were collected for analyses of inflammatory and hepatic injury markers. Primary rat hepatocytes were treated with BR and TNF-α, HepG2 and SH-SY5Y cell lines were treated with BR and chenodeoxycholic acid. LPS-treated Gunn rats had a significantly decreased inflammatory response and hepatic injury compared to LPS- treated normobilirubinemic controls. We found different profile of leukocytes subsets and decreased systemic mRNA expressions and concentrations of IL-6, TNF-α, IL-1β and IL-10 in Gunn rats. Hepatic mRNA expression of LPS-binding protein was upregulated in Gunn rats before and after LPS treatment. In addition, activities of AST and ALT, markers of hepatocellular damage, were lower in Gunn rats as compared to LPS-treated controls. The exposure of primary hepatocytes to TNF-α resulted in the activation of the NF-κB pathway and phosphorylation of its p65 subunit, however, the degree of p65 phosphorylation was significantly decreased by BR. BR also reduced chenodeoxycholic acid- induced oxidative stress in vitro. A LC-MS/MS method for the simultaneous determination of lumirubin and BR was linear up to 400 µmol/L for BR and to 100 µmol/L for lumirubin with submicromolar limits of detection, with validity parameters relevant for use in clinical chemistry. In conclusion, our results indicate that hyperbilirubinemia in Gunn rats is associated with an attenuated systemic inflammatory response and decreased liver damage upon exposure to LPS. Simultaneously, we confirmed the role of BR in protecting cells against oxidative stress induced by chenodeoxycholic acid. A LC-MS/MS method for the simultaneous determination of BR and lumirubin was established and validated. Key words: bilirubin, hyperbilirubinemia, inflammation, LPS, NF-κB, oxidative stress, LC-MS/MS
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Petra Valášková 3 MB
Stáhnout Příloha k práci Bc. Petra Valášková 13.07 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Petra Valášková 436 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Petra Valášková 427 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Bc. Petra Valášková 935 kB
Stáhnout Posudek vedoucího MUDr. Lucie Muchová, Ph.D. 1.5 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Markéta Martínková, Ph.D. 2.47 MB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Karel Dvořák, Ph.D. 123 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc. 1.67 MB