velikost textu
Antioxidační a protizánětlivé účinky bilirubinu.
Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Antioxidační a protizánětlivé účinky bilirubinu.
Název v angličtině:
Antioxidant and antiinflammatory effects of bilirubin.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Bc. Petra Valášková
Školitel:
MUDr. Lucie Muchová, Ph.D.
Oponenti:
doc. RNDr. Markéta Martínková, Ph.D.
Id práce:
156066
Fakulta:
1. lékařská fakulta (1.LF)
Pracoviště:
Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN v Praze (11-00410)
Program studia:
Biochemie a patobiochemie (P1412)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
bilirubin, hyperbilirubinémie, zánět, LPS, NF-κB, oxidační stres, LC-MS/MS
Klíčová slova v angličtině:
bilirubin, hyperbilirubinemia, inflammation, LPS, NF-κB, oxidative stress, LC-MS/MS
Abstrakt:
Abstrakt
Bilirubin (BR) byl dlouho považován pouze za odpadní molekulu s potenciálně
toxickými účinky zejména na centrální nervový systém. Později bylo zjištěno, že BR působí i
cytoprotektivně a mírně zvýšené koncentrace BR vykazují antioxidační, protizánětlivé
a imunomodulační účinky, nicméně přesné mechanismy jsou stále předmětem intenzivního
výzkumu. Hlavním cílem této práce bylo studium protektivních účinků BR na experimentálních
in vivo a in vitro modelech ve vztahu k zánětu a oxidačnímu stresu. Dílčím cílem práce bylo
zavedení a validace analytické metody pro stanovení BR a lumirubinu.
Potkanům kmene Gunn a příslušným normobilirubinemickým kontrolám byl aplikován
lipopolysacharid (LPS, 6 mg/ml, i.p.) nebo fyziologický roztok. Po 12 hodinách byla odebrána
krev a vybrané orgány na analýzu markerů zánětu a jaterního poškození. Primární hepatocyty
izolované z jater experimentálních potkanů byly ovlivněny BR
a TNF-α, buněčné linie HepG2 a SH-SY5Y byly ovlivněny BR a kyselinou
chenodeoxycholovou. Hyperbilirubinemičtí potkani měli po aplikaci LPS ve srovnání
s normobilirubinemickými potkany signifikantně sníženou zánětlivou odpověď a stupeň
jaterního poškození. U potkanů kmene Gunn jsme pozorovali odlišný profil podskupin
leukocytů a zároveň snížení exprese mRNA a koncentrace cytokinů IL-6, TNF-α, IL-1β
a IL-10 ve srovnání s kontrolami. Exprese mRNA LBP (proteinu vázajícího LPS) byla
u potkanů Gunn zvýšena před i po aplikaci LPS oproti kontrolám. Zároveň byla aktivita AST a
ALT, markerů hepatocelulárního jaterního poškození, významně nižší u potkanů kmene Gunn
ve srovnání s kontrolami ovlivněnými LPS. Expozice primárních hepatocytů TNF-α vedla k
aktivaci dráhy NF-κB a fosforylaci její podjednotky p65, BR stupeň fosforylace této
podjednotky signifikantně snižoval. BR také snižoval oxidační stres vyvolaný kyselinou
chenodeoxycholovou in vitro. Metoda LC-MS/MS pro současné stanovení BR a lumirubinu
byla lineární až do 400 µmol/1 pro BR a 100 µmol/l pro lumirubin se submikromolárními limity
detekce a s parametry platnými pro relevantní použití v klinické chemii.
Závěrem lze říci, že hyperbilirubinémie u potkanů kmene Gunn je spojena se sníženým
stupněm zánětu a nižším jaterním poškozením po expozici LPS. Současně jsme potvrdili úlohu
BR při ochraně buněk před oxidačním stresem vyvolaným kyselinou chenodeoxycholovou.
Byla zavedena a validována LC-MS/MS metoda pro současné stanovení BR a lumirubinu.
Klíčová slova: bilirubin, hyperbilirubinémie, zánět; LPS; NF-κB, oxidační stres, LC-MS/ MS
Abstract v angličtině:
Abstract
For a long time, bilirubin (BR) has been considered a waste molecule with potential
toxic effects especially on the central nervous system. Later, it was found that BR exhibited
cytoprotective effects and mildly elevated BR levels showed antioxidant, anti-inflammatory
and immunomodulatory properties, however, exact mechanisms of the anti-inflammatory
actions of BR have not been fully understood yet. The main aim of this study was to assess the
protective effects of BR using experimental in vivo and in vitro models in relation to
inflammation and oxidative stress. Partial goal was to establish validated analytical method for
determination of BR and lumirubin.
Gunn and heterozygous rats were treated with lipopolysaccharide (LPS, 6 mg/kg, IP) or
vehicle (saline). After 12 hours, blood and organs were collected for analyses of inflammatory
and hepatic injury markers. Primary rat hepatocytes were treated with BR and TNF-α, HepG2
and SH-SY5Y cell lines were treated with BR and chenodeoxycholic acid. LPS-treated Gunn
rats had a significantly decreased inflammatory response and hepatic injury compared to LPS-
treated normobilirubinemic controls. We found different profile of leukocytes subsets and
decreased systemic mRNA expressions and concentrations of IL-6, TNF-α, IL-1β and IL-10 in
Gunn rats. Hepatic mRNA expression of LPS-binding protein was upregulated in Gunn rats
before and after LPS treatment. In addition, activities of AST and ALT, markers of
hepatocellular damage, were lower in Gunn rats as compared to
LPS-treated controls. The exposure of primary hepatocytes to TNF-α resulted in the activation
of the NF-κB pathway and phosphorylation of its p65 subunit, however, the degree of p65
phosphorylation was significantly decreased by BR. BR also reduced chenodeoxycholic acid-
induced oxidative stress in vitro. A LC-MS/MS method for the simultaneous determination of
lumirubin and BR was linear up to 400 µmol/L for BR and to 100 µmol/L for lumirubin with
submicromolar limits of detection, with validity parameters relevant for use in clinical
chemistry.
In conclusion, our results indicate that hyperbilirubinemia in Gunn rats is associated
with an attenuated systemic inflammatory response and decreased liver damage upon exposure
to LPS. Simultaneously, we confirmed the role of BR in protecting cells against oxidative stress
induced by chenodeoxycholic acid. A LC-MS/MS method for the simultaneous determination
of BR and lumirubin was established and validated.
Key words: bilirubin, hyperbilirubinemia, inflammation, LPS, NF-κB, oxidative stress,
LC-MS/MS
Dokumenty
| Stáhnout | Dokument | Autor | Typ | Velikost |
|---|---|---|---|---|
| Stáhnout | Text práce | Bc. Petra Valášková | 3 MB | |
| Stáhnout | Příloha k práci | Bc. Petra Valášková | 13.07 MB | |
| Stáhnout | Abstrakt v českém jazyce | Bc. Petra Valášková | 436 kB | |
| Stáhnout | Abstrakt anglicky | Bc. Petra Valášková | 427 kB | |
| Stáhnout | Autoreferát / teze disertační práce | Bc. Petra Valášková | 935 kB | |
| Stáhnout | Posudek vedoucího | MUDr. Lucie Muchová, Ph.D. | 1.5 MB | |
| Stáhnout | Posudek oponenta | doc. RNDr. Markéta Martínková, Ph.D. | 2.47 MB | |
| Stáhnout | Posudek oponenta | MUDr. Karel Dvořák, Ph.D. | 123 kB | |
| Stáhnout | Záznam o průběhu obhajoby | prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc. | 1.67 MB |