velikost textu

Development of inhibitors of rhomboid proteases as tools for the study of their biological functions

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Development of inhibitors of rhomboid proteases as tools for the study of their biological functions
Název v češtině:
Vývoj inhibitorů proteas z rodiny rhomboidů jako nástrojů pro studium jejich biologických funkcí
Typ:
Disertační práce
Autor:
Bc. Anežka Tichá
Školitel:
Mgr. Kvido Stříšovský, Ph.D.
Oponenti:
prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc.
doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc.
Id práce:
156065
Fakulta:
1. lékařská fakulta (1.LF)
Pracoviště:
Akademie věd ČR (11-00048)
Program studia:
Biochemie a patobiochemie (P1412)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
25. 4. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
intramembránová proteolýza, rhomboid, inhbitory rhomboidů, peptidyl ketoamidy, fluorogenní substráty
Klíčová slova v angličtině:
intramembrane proteolysis, rhomboid, rhomboid inhibitors, peptidyl ketoamides, fluorogenic substrates
Abstrakt:
ABSTRAKT Rhomboidy jsou serinové membránové proteasy, které patří do evolučně rozšířené rodiny rhomboidních proteinů. Rhomboidy si ve srovnání s klasickými serinovými proteasami vyvinuly odlišný katalytický mechanismus; místo běžně triády (Ser/His/Asp) k proteolýze využívají pouze katalytickou dyádu (Ser/His) a jejich aktivní místo se nachází uvnitř lipidové membrány, což — společně s faktem, že jsou hydrofobní — komplikuje jejich studium. Přestože je známé jejich zapojení v mnoha důležitých biologických procesech, stále u většiny rhomboidů není jasný konkrétní mechanismus, kterým přispívají k regulaci těchto procesů nebo k patologickým projevům souvisejících onemocnění (jako např. malárie, Parkinsonova choroba nebo rakovina). Pochopení těchto dějů je ztíženo nedostatkem nástrojů k jejich studiu jak in vitro, tak in vivo. Ve své práci uvádím nové fluorogenní substráty založené na Försterově rezonančním přenosu energie (FRET) a odvozené od sekvence LacYTM2, které umožňují široké využití pro kontinuální sledování aktivity mnoha rhomboidů in vitro. Modifikacemi v P5-P1 pozicích je možné zvýšit specifitu substrátu k cílovému rhomboidu, zatímco výběr FRET páru fluoroforů absorbujícího v červené oblasti viditelného světla umožňuje jejich využití pro rychlé testování knihoven molekul. Selektivní a účinné inhibitory jsou cenným nástrojem ke studiu molekulárních mechanismů enzymů, avšak pro rhomboidy zatím žádné takové inhibitory nejsou známy. Inhibitory vyvinuté v rámci této práce jsou netoxické, jednoduše synteticky dostupné a modifikovatelné. Inhibitory odvozené od N-methylen saccharinu nebo benzoxazin-4-onu sice nejsou dostatečně aktivní pro biologické aplikace, ale další modifikace by mohly vést ke zvýšení účinnosti. Peptidyl ketoamidy jsou inhibitory založené na mechanismu interakce rhomboidu se substrátem a jsou zatím nejslibnější skupinou inhibitorů rhomboidů. Spojují peptidovou část odvozenou od substrátu s ketoamidovou elektrofilní reaktivní skupinou rozšířenou hydrofobním substituentem. Výsledné inhibitory jsou účinné, selektivní, kovalentní a reversibilní. Vzhledem k jejich aktivitě in vivo při nízkých nanomolárních koncentracích jsou peptidyl ketoamidy v současnosti zdaleka nejefektivnějšími inhibitory rhomboidů. Optimalizace peptidové části a C-koncového hydrofobního substituentu umožní návrh selektivních inhibitorů dalších členů této rodiny.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Rhomboids are intramembrane serine proteases that belong to the evolutionarily widespread rhomboid superfamily. Rhomboids developed a slightly different catalytic mechanism compared to classical serine proteases; they utilise a catalytic dyad (Ser/His) instead of the common triad (Ser/His/Asp), and the rhomboid active site is buried in the membrane. This, coupled with their hydrophobicity, makes them quite difficult to study. Therefore, even though they are known to be involved in several important biological processes it is still not clear how exactly most of them are involved in the regulation of or in the pathologies of diseases related to these processes (such as malaria, Parkinson’s disease or cancer). Our understanding is hindered by the lack of tools for their characterisation both in vitro and in vivo. In my thesis I present new fluorogenic substrates based on the LacYTM2 sequence, which is hydrolysed by several different rhomboid proteases. Using Förster resonance energy transfer (FRET)-based methods, these substrates are suitable for continuous monitoring of rhomboid activity in vitro. Modifications in the P5-P1 residues can improve selectivity for a specific rhomboid, the choice of FRET pair of fluorophores that absorbes light of longer wavelengths makes them suitable for high throughput screening (HTS). Selective and potent inhibitors are a valuable tool for studying the molecular mechanisms underlying enzyme function. However, such inhibitors have been lacking for rhomboid proteases. The inhibitors developed in my thesis are non-toxic and easily synthetically accessible and modifiable. The inhibitors based on the N-methylen saccharin or the benzoxazin-4-one scaffold are not potent enough for direct cell biological use, but further derivatisation could lead to improvement in potency. The peptidyl ketoamides are based on the structural understanding of rhomboid specificity and mechanism and they are the most promising class. They combine a substrate-derived peptidyl part with the electrophilic reactive group of the ketoamide, extended by a hydrophobic substituent. The resulting inhibitor scaffold is potent, selective, covalent and reversible. With low nanomolar potency in vivo, peptidyl ketoamides are by far the most effective rhomboid inhibitors available. Modifications of the peptidyl part and the C-terminal hydrophobic substituent will enable tuning of inhibitor selectivity to diverse rhomboid proteases.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Anežka Tichá 35.94 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Anežka Tichá 421 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Anežka Tichá 419 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Bc. Anežka Tichá 1.96 MB
Stáhnout Posudek vedoucího Mgr. Kvido Stříšovský, Ph.D. 437 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc. 175 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. 179 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc. 408 kB