velikost textu

Molecular bases of sensitivity to electron transport chain inhibition-induced cell death

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molecular bases of sensitivity to electron transport chain inhibition-induced cell death
Název v češtině:
Molekulární podstata citlivosti k buněčné smrti indukované inhibicí-elektrontransportního řetězce
Typ:
Disertační práce
Autor:
Bc. Jan Blecha
Školitel:
Mgr. Jakub Rohlena
Oponenti:
doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D.
RNDr. Alena Pecinová, Ph.D.
Id práce:
155399
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
11. 4. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Mitochondrie, apoptóza, oxidační stres, proliferace, antioxidační ochrana, ATP, elektron transportní řetězec
Klíčová slova v angličtině:
Mitochondria, apoptosis, oxidative stress, proliferation, antioxidant defense, ATP, electron-transport chain
Abstrakt:
Abstrakt česky Látky cílené na mitochondriální elektron transportní řetězec (ETC) vykazují dobrý potenciál v protinádorové terapii, ale molekulární podstata jejich specificity stále není zcela objasněná. S přihlédnutím k tomu, že většina somatických buněk je v klidovém neproliferujícím stavu a je vůči těmto látkám inertní, změny mitochondriálního metabolismu spojené se vstupem do klidového stavu by mohli objasnit resistenci. Z tohoto důvodu jsme v předložené práci analyzovali stav ETC spolu s hlavními důsledky jeho inhibice jako je zvýšená produkce reaktivních kyslíkatých radikálů (ROS) a snížená produkce ATP na pozadí indukce programované buněčné smrt v modelech nádoru prsu a v proliferujících a klidových netransformovaných buňkách. V první řadě jsme charakterizovali efekt nově vyvinuté protirakovinné látky, mitochondriálně cíleného tamoxifenu (MitoTam), in vitro a in vivo v modelech nádoru prsu s rozdílnou expresí onkogenu Her2. Ukázali jsme, že podstatou protinádorového účinku látky MitoTAM je efektivní inhibice respiračního komplexu I provázená vysokou mírou produkce ROS a to zejména v nádorech se zvýšenou hladinou Her2, které vykazují vyšší míru uspořádanosti ETC do superkomplexů spojenou s vyšší mírou respirace. Tyto výsledky naznačily, že nádory s vyšší mitochondriální respirací jsou citlivější k eliminaci inhibitory ETC v důsledku zvýšené produkce ROS a následném rozpadu vyšších respiračních struktur. Dále jsme zjišťovali, zda bioenergetické rozdíly mezi proliferujícími a klidovými buňkami, které reprezentují nádorové, respektive somatické buňky, mohou vysvětlit specificitu látek cílených na ETC. Endoteliální (EA.hy926) a epiteliální (MCF10A) buněčné linie byly vystaveny činidlům působících oxidační stres nezávisle na ETC, inhibitorům ETC či inhibitorům mitochondriální produkce ATP. Jedním z testovaných parametrů byla dostupnost glukózy v médiu. Koncentrace 4.5 g/L představovala dostatek a 1 g/L nedostatek tohoto sacharidu. Význam ETC ve studovaném jevu jsme ověřili na linii zbavené mtDNA s defektním ETC. Sledovali důležité metabolické parametry spojené s bioenergetikou, zejména buněčnou respiraci, antioxidační ochranu, ale též úroveň glykolýzy a syntézy ATP. Výsledky jsme poté ověřili na modelu FVB/c-neu myšího spontánního nádoru prsu. 1 Překvapivě jsme zjistili, že navzdory zvýšené míře uspořádanosti ETC a respirace v klidových buňkách, tyto buňky byly v případě dostatku glukózy méně citlivé k buněčné smrti indukované všemi testovanými látkami, což bylo provázeno nižší produkcí ROS. Klidové buňky měly zvýšenou proteinovou i aktivitní úroveň antioxidační ochrany (SOD2, TRX2, PRX3 a GPX) a genové utlumení SOD2 a TRX2 bylo provázeno zvýšenou mírou buněčné smrti specificky v klidových buňkách. Tyto výsledky naznačují, že zvýšená schopnost detoxifikovat ROS určuje citlivost klidových buněk k inhibici ETC v situaci, kdy glukóza není limitující. Oproti tomu nedostatek glukózy signifikantně zvýšil citlivost klidových buněk vůči inhibitorům ETC a mitochondriální syntézy ATP, zatímco citlivost vůči induktorům ROS nezávislým na ETC zůstala nezměněna. V případě inhibitorů ETC a ATP syntézy jsme zaznamenali souvislost s letálním úbytkem ATP, což bylo umocněno neschopností klidových buněk zvýšit příjem glukózy a doplnit tak ztrátu ATP v glykolýze. Pokusy s buňkami deficientním na ETC ukázaly, že funkční ETC doplňuje ochrannou úlohu antioxidantů v klidových buňkách. Tento zajímavý aspekt bude dále detailněji prošetřen v navazujícím projektu. Závěrem naše data naznačují, že inhibice ETC s následným vyčerpáním ATP je spouštěcím faktorem buněčné smrti v situaci nedostatečné glukózy, zatímco ROS indukované blokádou ETC iniciují buněčnou smrt, když je glukóza v dostatku. Kombinace antioxidační ochrany a dostupnosti glukózy proto spolu-určuje molekulární specificitu buněčné smrti vyvolané inhibicí ETC. V důsledku toto vysvětluje, jak inhibice ETC může účinně zamezit rakovinné proliferaci bez významného vedlejšího poškození normální tkáně. 2
Abstract v angličtině:
Abstract in English Mitochondrial electron transport chain (ETC) targeting shows a great promise in cancer therapy. However, why modern ETC-targeted compounds are tolerated on the organismal level and what are the molecular reasons for this tolerance remains unclear. Most somatic cells are in a non-proliferative state, and features associated with the ETC in quiescence might therefore contribute to specificity. Thus, we investigated the ETC status and the role of two major consequences of ETC blockade, reactive oxygen species (ROS) generation and inhibition of ATP production, in cell death induction in breast cancer cells and in proliferating and quiescent non-transformed cells. First, we characterised the effect of a newly developed ETC inhibitor mitochondria- targeted tamoxifen (MitoTam) in in vitro and in vivo tumour models of breast cancer with varying status of the Her2 oncogene. We document that Her2high cells and tumours have increased assembly of respiratory supercomplexes (SCs) and increased complex I-driven respiration in vitro and in vivo. They are also highly sensitive to MitoTam. Unlike the parental compound tamoxifen, MitoTam efficiently suppressed experimental Her2high tumours without systemic toxicity. Mechanistically, MitoTam inhibits complex I- driven respiration and disrupts respiratory SCs in Her2high background in vitro and in vivo, leading to elevated reactive oxygen species production and cell death. This suggests that in cancer settings increased respiration sensitizes to ETC inhibition by stimulating ROS generation. Next, we investigated if differences in mitochondrial respiration between proliferating and quiescent cells, representing cancerous and normal tissue, could explain the specificity of ETC targeting. Therefore, endothelium-derived (EA.hy926) and epithelium-derived (MCF10A) non-transformed cells capable of contact inhibition were cultured in low (1 g/L) and high glucose (4.5 g/L) media, representing conditions of limited and ample glucose supply, respectively. Both, proliferating and quiescent (contact-inhibited) cells were exposed to direct ROS inducers that do not interact with the ETC, specific inhibitors of the ETC or inhibitors of mitochondrial ATP production. We also performed similar experiments in EA.hy926 cells with depleted mitochondrial DNA featuring defective ETC to clarify ETC’s role in the selectivity phenomenon. Cell death and ROS production, as well as various metabolic parameters, particularly mitochondrial respiration, antioxidant defence expression and activity, glycolysis rate and ATP levels 1 were assessed. The role of several components of the antioxidant defence systems (SOD2- and GPX1-, TRX-reductase- and GSR) was interrogated by shRNA-mediated knockdown. In the end of study, we confirmed the results in vivo using FVBn/c-neu mouse model of spontaneous Her2high mammary carcinoma. Even though quiescent cells, compared to proliferating cells, featured increased SC assembly and a higher rate of respiration, proliferating cells were more susceptible to cell death induced by direct ROS inducers, ETC and ATP synthase inhibitors when cultured in high glucose conditions. All these agents also induced more ROS in proliferating cells. Interestingly, in low glucose conditions the pattern of cell death sensitivity was reversed for ETC and ATP synthase inhibitors, but not for direct ROS inducers. The amount of cell death in this situation correlated with significant ATP depletion in quiescent cells, rather than with ROS production. This was related to the inability of quiescent cells to compensate for the loss of mitochondrial ATP production by the upregulation of glucose uptake. Regardless of glucose availability, quiescent cells featured increased protein levels and activity of antioxidant enzymes (SOD2, TRX2, PRX3 and GPX). However, silencing of SOD2 or TRX-reductase 2 by RNA interference increased ETC inhibition- induced cell death and ROS production exclusively in quiescent cells under high glucose conditions. Experiments with ETC-deficient cells then revealed that functional ETC paradoxically complements the protective role of antioxidant defence in quiescent cells. This interesting aspect will be investigated in follow-up research. In conclusion, our data suggest that lack of ATP is the major factor for cell death induction when ETC is blocked in a situation of glucose limitation, while the amplitude of ROS generation becomes dominant when glucose is not limiting. The combination of antioxidant defence and glucose availability therefore co-determines the specificity of ETC-inhibition-induced cell death and explains why ETC inhibition can effectively suppress cancer without considerable collateral damage to normal tissue. 2
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Jan Blecha 8.15 MB
Stáhnout Příloha k práci Bc. Jan Blecha 3.87 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Jan Blecha 242 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Jan Blecha 237 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Bc. Jan Blecha 959 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D. 173 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Alena Pecinová, Ph.D. 163 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 164 kB