velikost textu

Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs
Název v češtině:
Klíčové faktory při výběru sestřihových míst v kódujících a v dlouhých nekódujících RNA
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Zuzana Krchňáková, Ph.D.
Školitel:
doc. Mgr. David Staněk, Ph.D.
Oponenti:
doc. Mgr. Petr Svoboda, Ph.D.
Mgr. Dalibor Blažek, Ph.D.
Id práce:
155390
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
14. 3. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
lncRNA, pre-mRNA sestřih, chromatin
Klíčová slova v angličtině:
lncRNA pre-mRNA splicing, chromatin
Abstrakt:
Abstrakt Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik málo proskoumaných oblastí regulace sestřihu RNA. V první části jsem analyzovala, jak chromatinové a transkripční regulační elementy mění sestřih pre-mRNA. Ve druhé části jsem studovala, proč jsou dlouhé nekódující RNA méně efektivně stříhané než mRNA kódující proteiny. Nakonec jsem zkoumala důležitost intronu pro aktivační funkci dlouhých nekódujících RNA. Bylo ukázáno, že chromatin a promotor mění alternativní sestřih. Zde jsem testovala, zda lokální chromatinové a vzdálené genomové prvky, které ovlivňují transkripci, mohou také modulovat sestřih. Použila jsem enzymy modifikující histony a pomocí TALE technologie je navedla na specifické oblasti ve FOSL1 genu. Pomocí tohoto přístupu jsem ukázala, že změny metylace v lyzínu 9 histónu H3 ovlivňují konstitutivní sestřih. Navíc podávám důkaz, že odstranení transkripčního zesilovače vzdáleného několik kilobází od alternativního exonu mění sestřih alternativního exonu. Mnohé dlouhé nekódujíci RNA podléhají stejnému mechanizmu zpracování jako pre- mRNA genů kódujících proteiny, ale často jsou neefektivně sestřiženy. Abychom identifikovali základní mechanismy tohoto jevu, hledali jsme možné inhibiční sekvence sestřihu u těchto dlouhých nekódujících RNA. Celogenomová analýza ukázala, že obecně dlouhé nekódujíci RNA neobsahují více inhibičních sekvencí sestřihu ve srovnání s geny kódující proteiny. Abych identifikovala sekvence inhibující sestřih nekódujících RNA, použila jsem ncRNA-a2 jako modelovou nekódující RNA a ukázala jsem, že neefektivní sestřih je nezávislý na sekvenci chromatinu nebo promotoru. Naopak, moje výsledky ukazují, že intronová sekvence ncRNA-a2 je hlavním určujícím činitelem neefektivního sestřihu. Dále poskytujeme experimentální důkazy, že zesílení 5'ss a zvýšení obsahu tymidinů v polypyrimidínové oblasti významně zlepšují sestřih dlouhých nekódujících RNA. Dále ukazujeme, že exony dlouhých nekódujících RNA obsahují méně vazebných míst pro SR proteiny a jsou vázány v mnohem menším rozsahu SR proteiny než mRNA kódující proteiny. Na základě našich výsledků navrhujeme, že dlouhým nekódujícím RNA schází komplexní interakční síť, která zlepšuje sestřih, což způsobuje, že výsledek jejich sestřihu je více závislý na optimální sekvenci sestřihových míst, které interagují přímo se sestřihovým komplexem. Nakonec jsme odstranili intron z ncRNA-a2 a testovali jsme, zda je proces sestřihu důležitý pro funkci této dlouhé nekódující RNA. Moje výsledky naznačují funkci DNA elementu spíše než samotného RNA produktu při podpoře transkripce sousedních genů. Bohužel jsme však nemohli rozlišit mezi těmito dvěma možnostmi, proto jsou třeba provést další experimenty s cílem poskytnout jednoznačnou odpověď.
Abstract v angličtině:
Abstract In my thesis, I focused on several underexplored areas of RNA splicing regulation. In the first part, I analyzed how chromatin and transcription regulatory elements change pre-mRNA splicing. In the second part, I studied why long non-coding RNAs (lncRNAs) are spliced less efficiently than protein-coding mRNAs. Finally, I was testing the importance of intron for the activating function of lncRNAs. It has been shown that chromatin and promoter identity modulate alternative splicing decisions. Here, I tested whether local chromatin and distant genomic elements that influence transcription can also modulate splicing. Using the chromatin modifying enzymes directly targeted to FOSL1 gene by TALE technology, I showed that changes in histone H3K9 methylation affect constitutive splicing. Furthermore, I provide evidence that deletion of transcription enhancer located several kilobases upstream of an alternative exons changes splicing pattern of the alternative exon. Many nascent lncRNAs undergo the same maturation steps as pre-mRNAs of protein- coding genes (PCGs), but they are often poorly spliced. To identify the underlying mechanisms for this phenomenon, we searched for putative splicing inhibitory sequences. Genome-wide analysis of intergenic lncRNAs (lincRNAs) revealed that, in general, they do not contain more splicing inhibitory sequences compared to PCGs. Using ncRNA-a2 as a model, we provide evidence that its inefficient splicing is independent of chromatin or promoter sequence. On the contrary, we show that the intron sequence of ncRNA-a2 is a major determinant of its inefficient splicing. Additionally, we provide experimental evidence that the strengthening of the 5’ splice site and increasing the thymidine content in polypyrimidine tract significantly enhance lincRNA splicing. We further show that lincRNA exons contain less putative binding sites for SR proteins and are bound to a much lower extent by SR proteins than expression-matched PCGs. We propose that lincRNAs lack the cooperative interaction network that enhances splicing, which renders their splicing outcome more dependent on the optimality of splice sites. Finally, we removed intron from ncRNA-a2 and tested whether the splicing process is important for the function of an enhancer-like lncRNA. My results suggest the functionality of DNA element of ncRNA-a2 locus rather the RNA product itself in the promoting transcription of neighboring genes. However, we could not distinguish between these two possibilities thus future experiments have to be done to provide a definite answer.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Zuzana Krchňáková, Ph.D. 15.78 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Zuzana Krchňáková, Ph.D. 112 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Zuzana Krchňáková, Ph.D. 96 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Zuzana Krchňáková, Ph.D. 76 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. Mgr. Petr Svoboda, Ph.D. 281 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Dalibor Blažek, Ph.D. 310 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 174 kB