velikost textu

Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Structure and dynamics of mouse C-type lectin-like receptors.
Název v češtině:
Struktura a dynamika myších inhibičních receptorů podobných lektinům C-typu
Typ:
Disertační práce
Autor:
Bc. Lucie Hernychová
Školitel:
RNDr. Petr Novák, Ph.D.
Oponenti:
RNDr. Veronika Obšilová, Ph.D.
prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D.
Id práce:
155265
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra buněčné biologie (31-151)
Program studia:
Imunologie (P1517)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
31. 5. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
rekombinantní proteiny, transfekce, fluorescenční mikroskopie, hmotnostní spektrometrie
Klíčová slova v angličtině:
recombinant proteins, transfection, fluorescent microscopy, mass spectrometry
Abstrakt:
Abstrakt NK buňky jsou schopné rychle rozpoznat buňky infikované virem nebo také nádorové buňky a podílí se na regulaci odpovědí adaptivní imunity, proto představují velmi důležitou součást přirozené imunity. Funkce NK buněk jsou zajišťovány souhrou mezi jejich receptory, které dohromady vytváří složitý regulační systém. Vyřešení struktury jednotlivých receptorů by mohlo přispět k porozumění NK- buněčné biologie. Předkládaná dizertační práce je věnována řešení struktury inhibičního receptoru C-lektinového typu (CTLR) Nkrp1b, především je pak zaměřena na ty části jeho struktury (krček, smyčka a oligomerní stav), které mohou ovlivnit celkovou konformaci receptoru a také jeho interakce. Vazba receptoru Nkrp1b s jeho ligandem, proteinem Clr-b, je imunologicky významná, jelikož nezávisle reguluje aktivitu NK buněk a monitoruje změny, které nejsou detekovatelné cytotoxickými T lymfocyty. Aby mohly být studovány jednotlivé strukturní charakteristiky proteinu Nkrp1b, byly připraveny dvě jeho varianty: celá ektodoména a ligand-vazebná doména postrádající krček. S využitím několika různých technik hmotnostní spektrometrie v kombinaci s homologním modelováním a molekulární dynamikou byla navržena struktura receptoru Nkrp1b včetně jeho monomerního a dimerního uspořádání. Dále byl zkoumán oligomerizační stav receptoru připraveného v jeho plné délce v savčích buňkách pomocí western blotu. Bylo zjištěno, že jak Nkrp1b připravené v bakteriích, tak i v savčích buňkách jsou směsí monomerů a homodimerů. Nakonec byla s využitím fluorescenční mikroskopie testována biologická aktivita forem proteinu Nkrp1b, kdy se ukázalo, že pouze monomerní varianty proteinu (ať už s krčkem, nebo bez) jsou schopny interakce s ligandem. Na základě získaných dat je zjevné, že krček nemá vliv na konformaci proteinu Nkrp1b ani na jeho dimerizaci, jak se po desetiletí předpokládalo, a stejně tak ani neovlivňuje schopnost interakce receptoru s ligandem. Přestože se Nkrp1b vyskytuje i ve formě homodimeru, biologicky aktivní jsou pouze jeho monomerní formy. To by naznačovalo, že homodimery by mohly zastávat regulační funkci.
Abstract v angličtině:
Abstract Natural killer (NK) cells represent indispensable part of the innate immunity as they are capable of promptly identifying virally infected or tumor cells and participating in the regulation of adaptive immune responses. These functions are ensured by the interplay between NK receptors, creating a complex regulatory system. Solving the receptors’ structure may contribute to an overall understanding of NK cell biology. Presented thesis describes an elucidation of the structure of the inhibitory C-type lectin-like receptor (CTLR) Nkrp1b with an emphasis toward structural features (stalk, loop and oligomerization state) which might affect conformation or interactions of this receptor. The interaction of Nkrp1b with its ligand, Clr-b protein, is immunologically significant as it regulates NK cells’ activity independently and monitors changes that are not visible to cytotoxic T lymphocytes. To study individual structural aspects of Nkrp1b, two protein variants were recombinantly prepared in bacterial expression system: entire ectodomain and ligand-binding domain lacking the stalk. Using a range of mass spectrometric techniques in combination with homology modeling and molecular dynamics, we proposed the Nkrp1b structure including its monomeric and dimeric arrangements. In addition, the oligomerization state of full-length Nkrp1b produced in mammalian cells was investigated using immunoblotting. The Nkrp1b proteins prepared in bacteria as well as in mammalian cells showed that the proteins either with or without stalk exist as a mix of monomers and homodimers. Finally, biological activity of Nkrp1b protein forms differing by the presence of the stalk and by the oligomerization state was tested using fluorescence microscopy. It was found that only monomeric forms regardless of the stalk were able to interact with a ligand. In conclusion, these results show that the stalk region does not affect protein fold or Nkrp1b dimerization as was assumed for decades, or even its ability to interact with the ligand. Only monomeric Nkrp1b forms are biologically active despite Nkrp1b homodimers occurrence. This opens the question of homodimers’ possible regulatory function.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Bc. Lucie Hernychová 5.94 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Bc. Lucie Hernychová 90 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Bc. Lucie Hernychová 84 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Bc. Lucie Hernychová 279 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Petr Novák, Ph.D. 623 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Veronika Obšilová, Ph.D. 499 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. Mgr. Marek Šebela, Dr., Ph.D. et Ph.D. 499 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 135 kB