velikost textu

Vyšetření genů DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 a SOD1 u českých pacientů s dědičnou neuropatií axonálního typu

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Vyšetření genů DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 a SOD1 u českých pacientů s dědičnou neuropatií axonálního typu
Název v angličtině:
Examination of the genes DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 and SOD1 among Czech patients with hereditary neuropathy axonal type
Typ:
Disertační práce
Autor:
RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D.
Školitel:
MUDr. Petra Laššuthová, Ph.D.
Oponenti:
MUDr. Eva Vlčková, Ph.D.
RNDr. Peter Vasovčák, Ph.D.
Konzultant:
Prof. MUDr. Pavel Seeman, Ph.D.
Id práce:
154134
Fakulta:
2. lékařská fakulta (2.LF)
Pracoviště:
Klinika dětské neurologie (13-441)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
24. 1. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
Charcot-Marie-Tooth neuropatie, DNM2, GARS, MORC2, TRPV4, SOD1, epilepsie, Sangerovo sekvenování, masivně paralelní sekvenování, celoexomové sekvenování
Klíčová slova v angličtině:
Charcot-Marie-Tooth neuropathy, DNM2, GARS, MORC2, TRPV4, SOD1, epilepsy, Sanger sequencing, masivelly parallel sequencing, whole exome sequencing
Abstrakt:
Vyšetření genů DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 a SOD1 u českých pacientů s dědičnou neuropatií axonálního typu V dizertační práci jsem se zaměřila na diagnostiku axonální formy dědičné neuropatie, protože v té době byla u pacientů s axonální formou CMT výrazně nižší objasnitelnost metodami klasické molekulární genetiky než u pacientů s demyelinizačními typy CMT. Pro další vyšetření u pacientů bez objasněné příčiny axonální formy CMT byly zvoleny geny DNM2, GARS a TRPV4. Cílem bylo zjistit spektrum a frekvenci mutací v těchto genech jako příčiny CMT2 u českých pacientů. Dále jsme v průběhu řešení projektu přidali vyšetření genů MORC2 a SOD1. Kauzální varianty v těchto dvou genech byly prokázány u našich pacientů pomocí celoexomového sekvenování. Proto jsme následně vyšetřili i větší skupinu pacientů na přítomnost variant v těchto dvou genech, s cílem zjistit, jak časté jsou tyto varianty v české populaci. Klasickým Sangerovým sekvenováním jsem vyšetřila reprezentativní soubor pacientů s CMT2 na přítomnost variant v genech: DNM2 (37 pacientů), GARS (10 pacientů), TRPV4 (24 pacientů) a SOD1 (43 pacientů). Metodou RFLP jsem vyšetřila 161 pacientů na přítomnost varianty p.Arg190Trp v genu MORC2. Soubor pacientů s CMT2 (50 pacientů) jsme podrobili také analýze metodou MLPA pomocí kitu na detekci duplikací a delecí pro geny RAB7A, GARS, HSPB1, HSBP8 a SPTLC1 (kit P406-A1 CMT2). Nenašli jsme žádnou odchylku v počtu kopií (CNV). V té době docházelo k rozvoji masivně paralelního sekvenování (MPS) a po zvážení finanční náročnosti klasického sekvenování versus MPS jsme se rozhodli geny DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 a SOD1 zařadit do panelu 97 genů v současnosti spojovaných s dědičnými neuropatiemi. Pomocí MPS jsme vyšetřili 217 pacientů. Vedlo to k následujícím zjištěním a objevům u CMT2. 1. Byla nalezena varianta NM_002047.2(GARS):c.2074A>G (p.Met692Val) v GARS genu, která je nejspíše nepatogenní, resp. není příčinou CMT2 v rodině, nesegreguje s onemocněním v rodině. 2. U pacientky s časným začátkem neuropatie v dětství, skoliózou a dušností, MPS objasnilo příčinu onemocnění a to v důsledku kauzální varianty NM_021625.4(TRPV4):c.557G>A (p.Arg186Gln) v exonu 3 TRPV4 genu. Mutace již byla popsána jako patogenní (Landoure et al. 2010). Naši kazuistiku jsme publikovali v časopise Neurologie pro praxi (Mazanec et al. 2016). 3. V DNM2 genu jsme pomocí celoexomového sekvenování zachytili 2 varianty u 2 nepříbuzných pcientů, jednak: NM_001005360.2(DNM2):c.1102G>A (p.Glu368Lys) v heterozygotním stavu a dále NM_001005360.2(DNM2):c.1393C>T (p.Arg465Trp), obě varianty byly již popsány jako příčina centronukleární myopatie (Bitoun et al. 2005) a fenotyp našich pacientů této diagnoze odpovídá. 4. MPS nám umožnilo detekovat i jiné varianty a rozšířit tak spektrum mutací spojovaných s axonální CMT a HMN. Příkladem je MORC2 gen, kde byla pomocí WES nalezena varianta NM_014941.2(MORC2):c.568C>T (p.Arg190Trp) v heterozygotním stavu u pacienta s obtížnou chůzí, svalovou slabostí a progresí onemocnění, varianta je popisována jako mutační hotspot. Restrikční analýzou navrženou na štěpení wild type alely v souboru 161 pacientů jsme danou variantu nalezli ještě u jednoho nepříbuzného pacienta. 5. U velké české rodiny s klinickým fenotypem pomalu progredující familiární ALS (FALS) a s výskytem celkem v 5 generacích, jsme pomocí celoexomového sekvenování nalezli kauzální mutaci NM_000454.4(SOD1):c.140A>G (p.His47Arg). Všichni postižení členové rodiny nesou v exonu 4 SOD1 genu mutaci c.140A>G (p.His47Arg) v heterozygotním stavu. Tato mutace byla již popsána jako patogenní a příčina HMN v článku Ostern et al. 2012.
Abstract v angličtině:
Examination of the genes DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 and SOD1 among Czech patients with hereditary neuropathy axonal type For my PhD thesis I chose to work with patients with axonal form of CMT, because at that time axonal forms were less likely to be clarified by classical methods of molecular genetics. For further examination in patients with unclear cause of the axonal CMT, the genes DNM2, GARS and TRPV4 were selected. The aim was to determine the significance of pathogenic mutations in these genes as the cause of CMT2 in Czech patients. In the course, we identified causal variants in the genes MORC2 and SOD1 with WES. Therefore, we have tested additional CMT2 patients for the presence of these variants. Using Sanger sequencing, I examined a representative set of patients for the DNM2 (37), GARS (10) and TRPV4 (24) genes without finding a causal mutation, then we investigated genes SOD1 (43 patients) and MORC2 (161 patients). The cohort (50 patients) was also subjected to MLPA analysis using a P406-A1 CMT2 duplication and deletion detection kit for genes RAB7A, GARS, HSPB1, HSBP8 and SPTLC1 (kit P406-A1 CMT2). At that time, massively parallel sequencing (MPS) was becoming important. We compared the cost of classical sequencing versus MPS, and accordingly, we decided that the genes DNM2, GARS, MORC2, TRPV4 and SOD1 would now be included in the panel of 97 genes associated with hereditary neuropathies. We examined 217 patients with MPS. This led to several interesting findings. In the CMT2 cohort the most important were: 1. Finding the NM_002047.2(GARS):c.2074A>G (p.Met692Val) mutation in the GARS gene, which is probably non-pathogenic, respectively is not the cause of CMT2 in the family, not segregate with the disease in the family. 2. In a patient with early onset neuropathy in childhood, scoliosis and dyspnoea, MPS helped to identify the cause of the disease as a result of the causal mutation NM_021625.4(TRPV4):c.557G>A (p.Arg186Gln) in exon 3 of the TRPV4 gene. Mutation has already been described as pathogenic (Landoure et al. 2010). We have published our case report in Neurologie pro praxi (Mazanec et al. 2016). 3. In the DNM2 gene, MPS sequencing revealed variant NM_001005360.2(DNM2):c.1102G>A (p.Glu368Lys) in heterozygous state and NM_001005360.2(DNM2):c.1393C>T (p.Arg465Trp) which is associated with centronuclear myopathy (Bitoun et al. 2005) and the phenotype of our patients is explanable by the mutation. 4. MPS has allowed us to detect other variants to extend the spectrum of mutations associated with axonal CMT and HMN. For example variant in the MORC2 gene NM_014941.2(MORC2):c.568C>T (p.Arg190Trp) in exon 10 was found in a heterozygous state in a patient with difficulty with walking, muscle weakness and disease progression, the variant being described as a mutation hotspot. Restriction analysis, designed to digest the mutant allele, in a group of 161 patients has found the variant in one other patient. 5. In a large Czech family with a clinical phenotype of slowly progressive familial ALS (FALS) and occurring in a total of 5 generations, WES analysis found that members of the family carry in exon 4 of the SOD1 gene a mutation of NM_000454.4(SOD1):c.140A>G (p.His47Arg) in heterozygous state. It has already been described as pathogenic in Ostern et al. 2012.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D. 3.09 MB
Stáhnout Příloha k práci RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D. 19.2 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D. 602 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky RNDr. Jana Neupauerová, Ph.D. 598 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. Eva Vlčková, Ph.D. 744 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Peter Vasovčák, Ph.D. 606 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 440 kB