velikost textu

Maintenance of chromosomes integrity in Giardia intestinails as a model organism.

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Maintenance of chromosomes integrity in Giardia intestinails as a model organism.
Název v češtině:
Udržování integrity chromosomů na modelu Giardia Intestinalis.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Magdalena Uzlíková, Ph.D.
Školitel:
RNDr. Eva Nohýnková, Ph.D.
Oponenti:
Marco Lalle, Dr., Ph.D.
MUDr. František Stejskal, Ph.D.
Id práce:
154132
Fakulta:
1. lékařská fakulta (1.LF)
Pracoviště:
Klinika infekčních a tropických nemocí 1. LF UK v Praze a Nemocnice Na Bulovce (11-00850)
Program studia:
Parazitologie (P1522)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
27. 9. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
Giardia intestinalis, afidikolin, metronidazol, chromosomy, protist, poškození DNA, telomery, telomeráza, FISH, TRAP assay
Klíčová slova v angličtině:
Giardia intestinalis, aphidicolin, metronidazole, chromosomes, protist, DNA damage, telomeres, telomerase, FISH, TRAP assay
Abstrakt:
Abstrakt Giardia intestinalis je kosmopolitní jednobuněčný organismus způsobující průjmy. Kromě klinického významu, jsou tito dvoujaderní prvoci zajímaví také z hlediska postavení v rámci eukaryot. Jsou evolučně vzdálení obvyklým modelovým organismům a dokonale přizpůsobeni parazitickému způsobu života. Jejich genom je poměrně malý, obsahuje velice málo nekódujících oblastí a mnohé z genů známých u jiných organismů u giardií chybí, tyto vlastnosti z nich dělají atraktivní model pro studium schopnosti buňky fungovat s minimální výbavou. Předkládaná práce přináší nová dílčí zjištění o různých úrovních udržování chromozomové stability u tohoto parazita. Jednou z nich je způsob ochrany konců chromozomů, tzv. telomer. Podařilo se nám lokalizovat telomery na koncích chromozomů v různých fázích buněčného cyklu a zpřesnit jejich přibližnou délku na 0,5 až 2,5 kb. Prokázali jsme existenci aktivního enzymu telomerázy odpovědného za přidávání telomerických repetic na konce chromozomů, ačkoliv se jedná o enzym strukturně odlišný od jiných eukaryot. Tyto poznatky ukazují, že giardie, stejně jako většina eukaryot, vyvinula konzervativní způsob, jak zamezit zkracování telomer. Popisujeme také účinek léku pro léčbu giardiózy, metronidazolu, na DNA a buněčný cyklus citlivých a rezistentních buněčných linií giardií. Metronidazol způsobuje fosforylaci histonu H2A v jádrech a naštípání DNA. Subletální koncentrace prodlužuje replikaci, na rozdíl od letální dávky, která vede k rychlé ztrátě schopnosti buněk přilnout k povrchu přičemž buněčný cyklus není ovlivněn. Tato pozorování ukazují, že prvotní reakcí buněk na letální koncentraci metronidazolu není poškození DNA, ale spíše okamžité vzájemné působení mezi metronidazolem a nejbližšími biomolekulami v místě, kde dochází k tvorbě cytotoxické formy metronidazolu. U rezistentních linií je přibližně 40% buněk pozitivní na přítomnost fosforylované formy H2A histonu, což ukazuje, že v těchto buňkách je neustále přítomna poškozená DNA, která by mohla přispívat ke zrychlené mutagenezi a tedy také vzniku přirozené rezistence. Je známo, že chromozomy giardií kondenzují. Popsali jsme celkovou morfologii chromosomů, stupně kondenzace a rozchod chromozomů v průběhu mitózy u tohoto parazita. Proces kondenzace chromozomů u giardií probíhá obdobně jako u jiných eukaryot, zvláštností oproti jiným organismům je způsob rozchodu chromozomů. U giardií se chromozomy neuspořádávají do ekvatoriální roviny, naopak dochází k průběžnému přesunu chromozomů k pólům vřeténka, což způsobuje opožďování přestupu chromatid do dceřiných buněk a mohlo by být vysvětlením pro aneuploidii, která je u tohoto parazita popisována. Na molekulární úrovni giardii chybí některé geny kódující proteiny kohesinového a kondenzinového komplexu, které mají roli v kondenzaci chromozomů a separaci chromozomů v mitóze. Nám se podařilo nalézt pravděpodobné členy rodiny kleisinů, kteří by mohli mít roli v tvorbě kondenzinového komplexu. Konečně, studovali jsme vliv inhibitoru afidikolinu na DNA a buněčný cyklus giardií. Tato látka je využívána pro synchronizaci buněk giardií a vede k zastavení buněčného cyklu na rozhraní G1 a S fáze. Prokázali jsme, že afidikolin způsobuje fosforylaci histonu H2A, měl by proto být použit v minimálních koncentracích, po co nejkratší dobu a s vědomím, že u buněk je aktivována odpověď na poškození DNA.
Abstract v angličtině:
Abstract Giardia intestinalis is a protozoan causing diarrhea worldwide. Beside its medical importance, it is evolutionary distant protist with two nuclei within a cell adapted for parasitic life in the environment poor of oxygen. Its genome is small and compact in term of gene content and size. It is therefore an attractive model organism for studies of minimal requirements for cellular processes. Present work brings new partial information on different levels of chromosome integrity maintenance of this parasite. Our study presents characteristics of chromosome termini and their protection. We localized telomeres during all stages of the trophozoite cell cycle and determined the length of Giardia telomeres ranging from 0.5 to 2.5 kb, we proved an existence of an active telomerase enzyme synthesizing telomeric repeats in in this parasite, despite the fact that giardial telomerase is structurally divergent. Present data support the view that the chromosomal termini in Giardia are maintained in a conservative manner that is common to other eukaryotes. We described effects of commonly used drug for treatment of anaerobic infections, metronidazole, on DNA and cell cycle progression in susceptible and resistant cell lines. Incubation of cells with this drug causes phosphorylation of histone H2A in cell nuclei and fragmentation of DNA. Sublethal concentration affects the replication phase of the cell cycle and lethal drug concentration lead to rapid loose of adherence ability without any effect on cell cycle progression. Our results support the view that the early reaction of cells to lethal concentration of metronidazole is not primarily initiated by the reaction to DNA damage but rather by the immediate interaction of the drug with biomolecules where active form of metronidazole is generated. In resistant lines incubated in the presence of the drug, about 40% of cells remain permanently positive for H2A in nuclei without any effects on the cell cycle progression. This suggests that DNA damage caused by this drug treatment persists in these cells and may contribute to accelerated mutagenesis and consequently to the development of natural resistance. Chromosomes in Giardia condense, we described the overall morphology, condensation stages, and mitotic segregation of these chromosomes, which is similar to other model eukaryotes. Differently, the anaphase poleward segregation of sister chromatids is atypical and tends to generate lagging chromatids between daughter nuclei which could explain existence of aneuploidy in this parasite. On molecular level, Giardia lacks several genes involved in the cohesion and condensation pathways, in present study we identified two putative members of the kleisin family thought to be responsible for condensin ring establishment. Lastly, we examined effects of synchronization agent aphidicolin on the nuclear cycle and cell cycle progression characteristics, as well as their reversibility. Treatment with aphidicolin leads to G1/S phase arrest and to phosphorylation of H2A histone. Thus, if aphidicolin is used for synchronization of Giardia trophozoites, this fact must be accounted for, and treatment with aphidicolin must be minimal.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Magdalena Uzlíková, Ph.D. 1.14 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Magdalena Uzlíková, Ph.D. 307 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Magdalena Uzlíková, Ph.D. 304 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Magdalena Uzlíková, Ph.D. 784 kB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Eva Nohýnková, Ph.D. 80 kB
Stáhnout Posudek oponenta Marco Lalle, Dr., Ph.D. 437 kB
Stáhnout Posudek oponenta MUDr. František Stejskal, Ph.D. 96 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. RNDr. Jan Tachezy, Ph.D. 1.93 MB