velikost textu

Molekulární syndromologie: molekulárně genetické příčiny vzácných onemocnění na příkladu Kabuki a Kabuki-like syndromů

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Molekulární syndromologie: molekulárně genetické příčiny vzácných onemocnění na příkladu Kabuki a Kabuki-like syndromů
Název v angličtině:
Molecular syndromology: molecular genetic causes of rare diseases illustrated with Kabuki and Kabuki-like syndromes
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Jana Paděrová
Školitel:
prof. MUDr. Milan Macek, DrSc.
Oponenti:
doc. MUDr. Alice Baxová, CSc.
doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.
Konzultant:
MUDr. Anna Křepelová, CSc.
Id práce:
154079
Fakulta:
2. lékařská fakulta (2.LF)
Pracoviště:
Ústav biologie a lékařské genetiky (13-716)
Program studia:
Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
12. 9. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Abstrakt:
Abstrakt Kabuki syndrom (KS) je dominantně dědičné onemocnění způsobené většinou de novo patogenními mutacemi v genech KMT2D (dříve MLL2) nebo KDM6A. Jedná se o vzácné multisystémové onemocnění charakterizované především intelektovou nedostatečností (ID – „intellectual disability“) a typickou obličejovou dysmorfií. KS je klinicky velmi heterogenní, což znesnadňuje jeho klinickou diagnostiku. Prvním cílem této dizertační práce bylo zavedení testování patogenních mutací ve dvou známých KS kauzálních genech metodou Sangerova DNA sekvenování a následně metodou MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) na pracovišti Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol a následně pak identifikace mutací v genech KMT2D či KDM6A u reprezentativního souboru 43 pacientů s fenotypem typickým pro KS, kteří byli indikováni k tomuto molekulárně genetickému vyšetření z několika spolupracujících genetických ambulancí v České republice. Výsledkem této studie bylo potvrzení či vyvrácení klinické diagnózy pacienta, studium spektra mutací v genech KMT2D/KDM6A v české populaci, korelace fenotypu s genotypem a zhodnocení využití fenotypového “MLL2-skóre” (publikovaného Markrythanasisem et al., 2013) jakožto predikčního nástroje k selekci pacientů pro sekvenování genu KMT2D. U 40% (17/43) analyzovaných pacientů s KS fenotypem byla nalezena mutace v genu KMT2D pomocí Sangerova DNA sekvenování, naprostá většina mutací byla protein zkracujícího typu a mutace se nacházely v různých exonech tohoto genu. Nebyla nalezena žádná mutace v genu KDM6A, ani žádná intragenová přestavba v žádném z obou genů pomocí metody MLPA. Rovněž nebyla nalezena korelace mezi konkrétní mutací a fenotypem studovaného onemocnění. Byla však nalezena výrazná korelace mezi fenotypem a přítomností či nepřítomností mutace v genu KMT2D vyjádřená pomocí “MLL2- skóre”, pacienti s patogenní mutací měli průměrné fenotypové skóre 7,4 (rozmezí 6-9), zatímco pacienti bez mutace 5 (rozmezí 2-7). Pacienti s KS se skóre 6 a více jsou tak vhodnými kandidáty pro cílenou sekvenaci genu KMT2D. Druhým cílem této práce bylo objasnit molekulárně genetickou podstatu Kabuki fenotypu u 18 pacientů bez mutace v genech KMT2D/KDM6A za použití metody aCGH následované sekvenovaním nové generace (NGS) zacíleným na klinický exom (CES), a tak zjistit, které genomové lokusy mohou způsobovat vzácná onemocnění podobající se KS – tj. syndromy Kabuki-like (KS-like). Pouze u 18 pacientů z 26 KMT2D/KDM6A negativních pacientů jsme obdrželi souhlas rodičů s provedením NGS. Taktéž bylo snahou ustanovit testovací algoritmus pro pacienty s KS a KS-like fenotypy. U 2 pacientek s KS-like fenotypem byly nalezeny kauzální genomické imbalance (Copy Number Variations – CNV) v lokusech Xp21.1-Xp21.3, respektive 14q11.2. U 4 pacientů s fenotypem KS-like byly nalezeny kauzální mutace v embryonálně exprimovaných genech, jejichž proteinové produkty se účastní regulace transkripce – gen KMT2A, mRNA sestřihu – gen EFTUD2, apoptózy – gen HUWE1 a přenosu signálu – gen GRIN1. U pacientů, kteří jsou KMT2D/KDM6A negativní, jsou aCGH následovaná CES metodami první volby, což představuje vhodný kaskádový testovací algoritmus, jehož záchytnost v naší kohortě byla relativně vysoká – 33% (6/18 pacientů se souhlasem k vyšetření pomocí NGS). Pacienti s fenotypovým skóre 5 a nižším mohou být neprodleně indikováni k aCGH/CES testování, jelikož u této skupiny nebyla nalezena mutace v genech KMT2D/KDM6A. Posledním cílem mé práce bylo testování využití CES u pacientů se vzácným onemocněním (VO) charakterizovaným syndromovou ID podobně jako u KS, ke zjištění molekulární příčiny těchto klinicky heterogenních onemocnění. U 15 z 60 testovaných pacientů byla pomocí této metody nalezena potenciálně patogenní či patogenní varianta, stanovující tak diagnostickou výtěžnost metody u syndromově asociované ID až na 25 %. V této skupině pacientů jsme diagnostikovali další dva pacienty s mutací v genu KMT2A, přestože nebylo u těchto pacientů vysloveno podezření na Wiedemann-Steiner syndrom, podobně jako u pacienta s fenotypem KS-like. Dále jsme nově asociovali histonovou demetylázu kódovanou genem KDM6B (ze stejné genové rodiny jako gen KDM6A) se syndromovově asociovanou ID. Identifikovali jsme dalšího pacienta s protein zkracující mutací v genu EFTUD2 a pacientku s mutací v genu GRIN2B, a to ze stejné skupiny genů jako GRIN1. U dalších dvou pacientů byla potvrzena autozomálně recesivní (AR) dědičnost jejich ID, u dvou pacientů X-vázaná (XL – X-linked) dědičnost. Metoda CES představuje metodu s vysokým záchytem u syndromových forem ID, a může tak poskytnout rychou diagnostiku, obzvláště pak u pacientů, kde je jejich klinický fenotyp nejednoznačný často díky variabilní klinické / věkové expresivitě jejich příznaků. Závěrem lze tedy říci, že řada pacientů se syndromově asociovanou ID má mutace v histonových metyltransferázách (obsahujících SET doménou) (KMT2A, KMT2D) a demetylázách (KDM6A, KDM6B), v genu pro spisozomální GTPázu (EFTUD2), v genech pro neurotransmiterové receptory aktivované glutamátem (GRIN1, GRIN2B) a v genech kódujících ubiquitin protein ligázy s HECT doménou (HUWE1, HECT2). Klíčová slova: aCGH, EFTUD2, fenotypizace, GRIN1, GRIN2B, HECT2, HUWE1, intelektová nedostatečnost (ID), Kabuki syndrom, KDM6A, KDM6B, klinický exom, KMT2A, KMT2D, MLL2-skóre, MLPA, molekulární syndromologie, NGS, Sangerovo DNA sekvenování, sekvenování klinického exomu (CES), sekvenování nové generace (NGS).
Abstract v angličtině:
Abstract Kabuki syndrome (KS) is a dominantly inherited rare disease caused mainly by de novo pathogenic variants (henceforward mutations) in the KMT2D (formerly MLL2) and KDM6A genes. It is rare multisystemic syndrome characterized by intellectual disability (ID) and typical facial dysmorphism. KS is clinically heterogeneous, which complicates its clinical diagnosis. The first aim of this thesis was to introduce mutation testing of the two known KS causative genes in KS by Sanger DNA sequencing and by MLPA (Multiple Ligation Probe Amplification) at the Department of Biology and Medical Genetics of 2nd Medical Faculty of Charles University and University Hospital Motol, Prague followed by identification of underlying genetic mutations in KMT2D/KDM6A genes in 43 patients with phenotype typical for KS, who were indicated for this molecular genetic analysis by several collaborating genetic departments in the Czech Republic. We aimed to confirm or disprove of patient’s clinical diagnosis, establish spectra of KMT2D/KDM6A mutations in the Czech population, render phenotype-genotype correlations and evaluate the phenotypic “MLL2-score” (published by Makrithanasis et al., 2013) utility as prediction tool for selection of cases for KMT2D sequencing. Mutations in the KMT2D gene were detected by Sanger DNA sequencing in 40 % (17/43) of analyzed patients with the KS phenotype, vast majority of mutations were protein truncating and these were located in various exons. No causal mutation was found in the KDM6A gene and no intragenic rearrangements were found in either of the two genes using MLPA analysis. In addition, no correlation was found between a particular mutation and the KS phenotype. However, there was correlation between the KS phenotype and the presence vs. absence of a mutation in the KMT2D gene, expressed by the “MLL2-score”. Patients with KMT2D mutation presented with average phenotypic score of 7,4 (range 6-9) and patients without a KMT2D mutation with an average score of 5 (range 2-7). KS patients with score of 6 and higher are thus good candidates for targeted KMT2D testing. The second aim of this study was to elucidate the molecular genetic cause of Kabuki phenotype in 18 patients lacking mutation in KMT2D/KDM6A genes using aCGH followed by Next Generation Sequencing (NGS) targeted to clinical exome (CES) and so determine genomic locuses that are responsible for rare diseases resembling KS – KS-like syndromes. Only in 18 patients out of the 26 KMT2D/KDM6A negative patients was granted consent with the NGS testing. Furthermore, we aimed to establish the most suitable testing algorithm in KS and KS-like cases. In two patients with KS-like phenotype we found causal genomic imbalances (Copy Number Variations / CNV) at Xp21.1-Xp21.3 and 14q11.2 loci, respectively. In four patients with KS-like phenotype we found mutations in embryonically expressed genes, whose protein products participate in the regulation of transcription – gene KMT2A, in mRNA splicing – gene EFTUD2, in apoptosis – gene HUWE1 and in signal transmission – gene GRIN1. In KMT2D/KDM6A negative patients are the aCGH followed by CES the methods of first choice, since the detection rate in our cohort is relatively high – 33 % (6/18 patients with NGS consent). Patients with the phenotypic score 5 and lower could be directly indicated to aCGH/CES testing, as in this cohort of patients no mutation in KMT2D/KDM6A genes was observed. The last aim of this study was an examination of the CES utility in patients with rare disease characterized by syndromic ID (i.e. similar to KS) and elucidation of molecular pathogenesis in those clinicaly heterogeneous disorders. In 15 out of 60 patients tested we found likely pathogenic or pathogenic variants, increasing the diagnostic yield to 25% in patients with syndromic ID. In this group of patients we diagnosed two additional patients with a mutation in the KMT2A gene, although there wasn’t original clinical suspicion of the Wiedeman-Steiner syndrome, i.e. similar as in the KS-like KMT2A-mutation positive patient. Furthermore, we were able to make novel connection of histone demethylase KDM6B (from the same gene family as KDM6A) with ID. In addition, we had identified another patient with protein truncating mutation in the EFTUD2 gene and a patient with mutation in the GRIN2B gene (from the same gene family as the GRIN1 gene). In two other patients autosomal recessive (AR) molecular cause of ID disase was revealed, in two patients X- linked (XL) inherited cause was observed. The NGS method aimed at the clinical exome has a high detection rate in patients with syndromic ID and may provide rapid diagnosis especially in cases, where their clinical phenotype is ambiguous, often due to variable clinical / age-related expressivity of their features. Many of the studied patients, with syndromic ID, have mutations in histone metyltransferases (with SET domain) (KMT2A, KMT2D) and demetylases (KDM6A, KDM6B), in splisosomal GTPase (EFTUD2), in genes coding for neurotransmitter receptors activated by glutamate (GRIN1, GRIN2B) and in ubiquitin protein ligases with HECT domain (HUWE1, HECT2). Key words: aCGH, clinical exome sequencing (CES), EFTUD2, GRIN1, GRIN2B, HECT2, HUWE1, intellectual disability (ID), Kabuki syndrome, KDM6A, KDM6B, KMT2A, KMT2D, MLL2-score, MLPA, molecular syndromology, Next Generation Sequencing (NGS), phenotyping, Sanger DNA sequencing
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Jana Paděrová 5.3 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Jana Paděrová 369 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Jana Paděrová 333 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. MUDr. Alice Baxová, CSc. 450 kB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc. 1.82 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 498 kB