Analýza genových produktů vznikajících v důsledku alternativního sestřihu pre-mRNA a jejich význam v onkogenezi karcinomu prsu.

Název:

Název v angličtině:

Analysis of pre-mRNA alternative splicing products and their importance in breast cancer oncogenesis.

Typ:

Disertační práce

Autor:

Mgr. Jan Hojný

Školitel:

MUDr. Petra Kleiblová, Ph.D.

Oponenti:

MUDr. Radek Malík

Mgr. Veronika Brynychová, Ph.D.

Id práce:

153854

Fakulta:

1. lékařská fakulta (1.LF)

Pracoviště:

Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK (11-00140)

Program studia:

Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (P1519)

Obor studia:

-

Přidělovaný titul:

Ph.D.

Datum obhajoby:

19. 9. 2019

Výsledek obhajoby:

Prospěl/a

Jazyk práce:

Čeština

Klíčová slova:

Alternativní sestřih, BRCA1, karcinom prsu, analýza genové exprese

Klíčová slova v angličtině:

Alternative splicing, BRCA1, breast cancer, gene expression analysis

Abstrakt:

ABSTRAKT Karcinom prsu je celosvětově nejčastěji diagnostikované nádorové onemocnění u žen. V 5-10 % všech případů je pozorována genetická souvislost, obvykle způsobená patogenní mutací v některém z predispozičních genů. Ačkoliv byla řada poškozujících mutací v kódující sekvenci těchto genů popsána, u velkého procenta familiárních případů (> 50 %) nebyla příčina dosud nalezena. Řada identifikovaných patogenních mutací byla lokalizována v konsenzních sestřihových místech, které mají za následek vznik aberantních sestřihových forem mRNA a z nich se odvíjející poškozené proteiny. Málo je však známo o variantách poškozujících regulační sestřihová místa, která mohou vést k tvorbě obdobných forem mRNA. Pro nepřímou analýzu variant, ovlivňujících přirozený sestřih, jsme navrhli metodiku detekce sestřihových variant jakéhokoliv genu založenou na multiplexní PCR a následné analýze pomocí NGS s vysokou citlivostí. Ověření této metodiky na modelu BRCA1 odhalila přítomnost 94 sestřihových variant v leukocytech periferní krve, zdravé prsní a přilehlé tukové tkáni, čímž byl vytvořen dosud nejpodrobnější katalog fyziologicky se vyskytujících mRNA variant BRCA1. Nejčastěji se vyskytující varianty, zachovávající čtecí rámec, byly přesně kvantifikovány pomocí RT-qPCR, která odhalila přítomnost 6 ubikvitně se vyskytujících alternativních transkriptů s relativní expresí > 1 % celkové exprese BRCA1 (Δ5; Δ9_10; Δ9_10,11q; ▼13 a IRIS). Dále jsme prokázali tkáňově specifickou míru exprese u variant Δ9_10, ▼13 a IRIS. Většina ubikvitních variant si pravděpodobně zachovává charakter wild-type formy, či vykazuje dosud neobjasněnou regulační funkci. Výsledky práce objasňují složení a množství mRNA variant BRCA1 v relevantních zdravých tkáních. Na základě tohoto katalogu je např. možné okamžitě identifikovat aberantní sestřihové mRNA varianty, vyskytující se v nádorové tkáni, či prokázat přítomnost mutace, vedoucí k deregulaci sestřihu pre-mRNA, v případě negativního výsledku mutační analýzy BRCA1. Klíčová slova: Alternativní sestřih, BRCA1, karcinom prsu, analýza genové exprese

Abstract v angličtině:

ABSTRACT Breast cancer is the most common tumor disease diagnosed in women worldwide. The hereditary character of this disease is observed in 5-10 % of all cases, and it is usually caused by a pathogenic mutation in one of the predisposition genes. Although a variety of pathogenic mutations in the coding sequences of these genes was described, the cause of the disease is still unknown in many familial cases (> 50%). A great number of identified pathogenic mutations were localized in the consensus splicing sites, which results in the formation of aberrant mRNA splicing variants and their damaged protein isoforms. However, little is known about mutations affecting regulatory splicing sites, which can result in the translation of similarly affected mRNAs. In this work, we proposed a method for indirect detection of mutations affecting the natural splicing pattern of any gene of our interest based on multiplex PCR and NGS with high sensitivity. Verification of this method on the BRCA1 model gene revealed the presence of the total of 94 splicing variants in peripheral leucocytes and healthy breast and adjacent fat tissues. This is the most detailed catalogue of physically occurring BRCA1 mRNA variants thus far. The most commonly occurring variants, maintaining open reading frame, were quantified by RT-qPCR which resulted in the characterization of 6 ubiquitously expressed alternative splicing variants with a relative expression > 1 % of total BRCA1 (Δ5; Δ9_10; Δ9_10,11q; ▼13 and IRIS). Furthermore, we detected tissue specific levels in the expression of Δ9_10, ▼13 and IRIS variants. The majority of ubiquitous variants probably result in protein isoforms which maintain the BRCA1 wild-type character or an unknown (probably regulatory) function. This study fully reveals the qualitative and quantitative splicing pattern of BRCA1 mRNA variants in relevant healthy human tissues. Based on this, we can instantly detect aberrantly spliced BRCA1 mRNA variants e.g. in tumor tissue and reveal the presence of mutation affecting the regulatory splicing site in cases of negative mutation analysis of BRCA1. Key words: Alternative splicing, BRCA1, breast cancer, gene expression analysis

Dokumenty

Stáhnout	Dokument	Autor	Velikost
Stáhnout	Text práce	Mgr. Jan Hojný	6.59 MB
Stáhnout	Příloha k práci	Mgr. Jan Hojný	3.35 MB
Stáhnout	Abstrakt v českém jazyce	Mgr. Jan Hojný	154 kB
Stáhnout	Abstrakt anglicky	Mgr. Jan Hojný	147 kB
Stáhnout	Autoreferát / teze disertační práce	Mgr. Jan Hojný	581 kB
Stáhnout	Posudek vedoucího	MUDr. Petra Kleiblová, Ph.D.	622 kB
Stáhnout	Posudek oponenta	MUDr. Radek Malík	6.47 MB
Stáhnout	Posudek oponenta	Mgr. Veronika Brynychová, Ph.D.	8 MB
Stáhnout	Záznam o průběhu obhajoby	doc. MUDr. Milada Kohoutová, CSc.	2.3 MB

Repozitář závěrečných prací

Veřejné aplikace

Analýza genových produktů vznikajících v důsledku alternativního sestřihu pre-mRNA a jejich význam v onkogenezi karcinomu prsu.