velikost textu

Generation and Characterization of Glutamate Carboxypeptidase II (GCPII)-Deficient Mice

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Generation and Characterization of Glutamate Carboxypeptidase II (GCPII)-Deficient Mice
Název v češtině:
Příprava a charakterizace myší s vyřazeným genem pro glutamátkarboxypeptidasu II.
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Barbora Vorlová
Školitel:
RNDr. Pavel Šácha, Ph.D.
Oponenti:
prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.
RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D.
Id práce:
147525
Fakulta:
1. lékařská fakulta (1.LF)
Pracoviště:
Akademie věd ČR (11-00048)
Program studia:
Biochemie a patobiochemie (P1412)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
30. 10. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
GCPII, PSMA, Folh1, myši s vyřazeným genem pro GCPII, geneticky modifikované myši, TALEN, zvětšené semenné váčky, urogenitální systém, ledviny, metabolomická analýza moči, NAAG, folát
Klíčová slova v angličtině:
GCPII, PSMA, Folh1, GCPII-deficient mice, knockout mice, TALEN, enlarged seminal vesicles, urogenital system, kidney, urine metabolomics, NAAG, folate
Abstrakt:
ABSTRAKT Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je transmembránový glykoprotein skládající se z krátké intracelulární a transmembránové domény a velké extracelulární domény, která vykazuje karboxypeptidasovou aktivitu. GCPII se podílí na neuromodulaci v mozku a absorpci folátů v tenkém střevě. Kromě těchto tkání se GCPII též vyskytuje v prostatě a ledvinách. Zde je ale její role neznámá. Za účelem zjištění funkce GCPII se několik vědeckých skupin pokusilo inaktivovat gen Folh1 (kódující GCPII) v myši. Tyto experimenty však vedly k rozporuplným výsledkům. Zatímco dvě studie ukázaly, že inaktivace genu Folh1 v myši vede k embryonální letalitě, jiné dvě studie publikovaly, že i po zmíněné inaktivaci jsou myši stále viabilní a navíc nevykazují žádný výrazný fenotyp. Cílem tohoto projektu bylo pokusit se připravit a charakterizovat myši s inaktivovaným Folh1 genem pomocí alternativní metody genetické modifikace. Za tímto účelem byly vytvořeny TALENy, které specificky cílily 11. exon genu Folh1 v myších zygotách genetického pozadí C57BL/6NCrl. Narozená mláďata generace F0 byla analyzována pro přítomnost mutací v rámci genu Folh1 a myši, které dohromady nesly 5 různých delecí, byly vybrány pro vytvoření mutantních linií. Linie, které nesly mutantní varianty genu Folh1 na obou alelách, neobsahovaly detekovatelnou hladinu GCPII. Bylo potvrzeno, že myši s vyřazeným genem pro GCPII jsou viabilní, nemají reprodukční problémy a obecně nevykazují žádný výrazný fenotyp. Modifikované myši byly použity pro zkoumání funkce GCPII v urogenitálním systému. Bylo zjištěno, že starší myši s vyřazeným genem pro GCPII mají zvýšený sklon k obstrukci semenných váčků. Zdroj tohoto fenotypu se ale nepodařilo objasnit. Ledviny starších modifikovaných myší nevykazovaly patologické změny a metabolomická analýza moči poukázala pouze na 3 ze 193 možných metabolitů, jejichž hladiny se u modifikovaných myší a myší divokého typu významně lišily. Kromě prokázání, že myši s vyřazeným genem pro GCPII jsou viabilní, by tento disertační projekt mohl napomoci k odhalení potenciální role GCPII v reprodukci. Pravděpodobný omezený vliv GCPII na funkci ledvin by poté mohl být užitečný pro vývoj protirakovinových léků cílených na GCPII.
Abstract v angličtině:
ABSTRACT Glutamate carboxypeptidase II (GCPII) is a transmembrane glycoprotein, which consists of short intracellular and transmembrane domains, and a large extracellular domain possessing carboxypeptidase activity. In the human body, GCPII fulfils a neuromodulatory function in the brain and facilitates folate absorption in the small intestine. In addition to the brain and small intestine, high level of GCPII is also present in the prostate and kidney. However, GCPII function in these tissues has not been determined yet. To study the role of GCPII in detail, several research groups attempted to inactivate GCPII encoding gene Folh1 in mice. Surprisingly, the experiments led to rather conflicting results ranging from embryonic lethality to generation of viable GCPII-deficient mice without any obvious phenotype. This dissertation project aimed to dissect the discrepancy using alternative strategy for gene modification. For this purpose, we designed TALENs that specifically targeted exon 11 of Folh1 gene and manipulated mouse zygotes of C57BL/6NCrl genetic background. We analysed all genetically modified mice of F0 generation for presence of TALEN-mediated mutations and established 5 different GCPII-mutant mouse colonies from founder mice that altogether carried 2 frame-shift mutations and 3 small in-frame deletions. We thoroughly characterized all 5 colonies and found out that GCPII is not expressed in any of mice homozygous for Folh1-mutant variant. We were thus able to generate viable GCPII-deficient mice that breed normally and do not show any overt phenotype. Produced GCPII-deficient mice were utilized for investigation of potential role of GCPII in the urogenital system. It was revealed that aged GCPII-deficient mice possess increased propensity to enlarged seminal vesicles, though the origin of this dilation is yet to be determined. In contrast, kidneys from aged GCPII-deficient mice did not display any pathological abnormalities and targeted metabolomics of mouse urine showed only 3 out of 193 measured metabolites discriminating GCPII-deficient and wild type mice. In addition to dissecting the discrepancy found in the literature by showing that GCPII- deficient mice are viable, this dissertation project may set the direction for revealing the GCPII function in reproduction. Strikingly, supposed unimportance of GCPII for kidney function may open the door for GCPII-targeted anti-cancer treatment.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Barbora Vorlová 21.85 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Barbora Vorlová 252 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Barbora Vorlová 247 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Barbora Vorlová 1.35 MB
Stáhnout Posudek vedoucího RNDr. Pavel Šácha, Ph.D. 535 kB
Stáhnout Posudek oponenta prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc. 548 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D. 779 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc. 719 kB