text size

Vývoj HPLC metody pro hodnocení metabolitů tryptofanu

Notice: I hereby declare that I am aware that the information acquired from theses published by Charles University may not be used for commercial purposes or may not be published for educational, scientific or other creative activities as activities of person other than the author.
Title:
Vývoj HPLC metody pro hodnocení metabolitů tryptofanu
Titile (in english):
Development of HPLC method for evaluation of tryptophan metabolites
Type:
Diploma thesis
Author:
Mgr. Barbora Pšenčíková
Supervisor:
PharmDr. Petr Kastner, Ph.D.
Opponent:
PharmDr. Radim Kučera, Ph.D.
Thesis Id:
146662
Faculty:
Faculty of Pharmacy in Hradec Králové (FaF)
Department:
Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis (16-16190)
Study programm:
Pharmacy (M5206)
Study branch:
Pharmacy (FAR)
Degree granted:
Mgr.
Defence date:
01/06/2020
Defence result:
Excellent
Language:
Czech
Abstract (in czech):
Abstrakt Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a farmaceutické analýzy Kandidát: Barbora Pšenčíková Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Název diplomové práce: Vývoj HPLC metody pro hodnocení metabolitů tryptofanu Esenciální aminokyselina tryptofan je prekurzorem mnoha biologicky aktivních látek. V posledních letech bylo zjištěno, že se metabolity tryptofanu účastní patogeneze mnoha onemocnění, včetně neurodegenerativních chorob, psychiatrických poruch, autoimunitních nemocí nebo rakoviny. Z toho důvodu jsou potřebné analytické metody, které jsou schopny současně detekovat tryptofan a jeho metabolity. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout optimální HPLC metodu pro hodnocení tryptofanu a jeho metabolitů (kynureninu, kyseliny kynurenové, serotoninu a 5-hydroxyindol-3-octové kyseliny) a prozkoumat možnosti hodnocení kyseliny chinolinové a melatoninu. Chromatografická separace byla provedena pomocí kolony Supelco Ascentis Express F5, velikost částic 2,7 μm, 15 cm × 3 cm, za použití spektrofotometrické a fluorescenční detekce. Parametry detekce byly: pro kynurenin UV detekce 369 nm, 254 nm, fluorescenční detekce Ex/Em: 369/475; pro kyselinu kynurenovou UV detekce 244 nm; pro tryptofan UV detekce 300 nm, fluorescenční detekce Ex/Em: 280/334; pro serotonin UV detekce 280 nm, fluorescenční detekce Ex/Em: 280/334, pro kyselinu 5-hydroxyindol-3-octovou UV detekce 276 nm, fluorescenční detekce Ex/Em: 276/333. Byly testovány různé typy mobilních fází. Konečná mobilní fáze se skládala z vody + acetátového pufru 0,1M pH 3,5/acetonitril v poměru 92/8. Separace byla provedena izokratickou elucí. Průtok byl stanoven na 0,5 ml/min a teplota kolony byla nastavena na 30 °C. Nastřikovaný objem byl 20 μl a celková analýza trvala 10 min. Metoda byla dále validována dle směrnic FDA a všechny validované parametry byly v přijatelném rozmezí. Klíčová slova: tryptofan, kynurenin, kyselina kynurenová, serotonin, kyselina 5-hydroxyindol-3-octová, kyselina chinolinová, melatonin, HPLC
Abstract:
Abstract Charles University Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmaceutical Analysis Candidate: Barbora Pšenčíková Supervisor: PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. Title of thesis: Development of HPLC method for evaluation of tryptophan metabolites The essential amino acid tryptophan is a precursor of several important bioactive compounds. In recent years it was found out that tryptophan metabolites are involved in the pathogenesis of many diseases, including neurodegenerative and psychiatric disorders, autoimmune diseases, or cancer. Therefore, the analytical methods for simultaneous determination of tryptophan and its metabolites are highly required. The purpose of this diploma thesis was to develop an optimal HPLC method for determination of tryptophan and its metabolites (kynurenine, kynurenic acid, serotonin and 5-hydroxyindole-3-acetic acid) and to consider all the possible options of determination of quinolinic acid and melatonin. The chromatographic separation was carried out by Supelco Ascentis Express F5 column, 2.7 μm particle size, 15 cm × 3 mm, using spectrophotometric and fluorescence detection. Parameters of detection were for kynurenine UV detection 369 nm, 254 nm, fluorescence detection Ex/Em: 369/475; for kynurenic acid UV detection 244 nm; for tryptophan UV detection 300 nm, fluorescence detection Ex/Em: 280/334; for serotonin UV detection 280 nm, fluorescence detection Ex/Em: 280/334, for 5-hydroxyindole-3-acetic acid UV detection 276 nm, fluorescence detection Ex/Em: 276/333. Various types of mobile phases were examined. The final mobile phase consisted of water + acetate buffer 0.1M pH 3.5/acetonitrile in a ratio 92/8. The separation was performed by isocratic elution. The flow rate was determined at 0.5 ml/min and the column temperature was set to 30 °C. The injection volume was 20 μl and total routine took 10 min. Furthermore, the method was validated according to FDA guidelines and all the validated parameters were within acceptable ranges. Key words: tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, serotonin, 5-hydroxyindole-3-acetic acid, quinolinic acid, melatonin, HPLC
Documents
Download Document Author Type File size
Download Text of the thesis Mgr. Barbora Pšenčíková 1.86 MB
Download Abstract in czech Mgr. Barbora Pšenčíková 103 kB
Download Abstract in english Mgr. Barbora Pšenčíková 108 kB
Download Supervisor's review PharmDr. Petr Kastner, Ph.D. 123 kB
Download Opponent's review PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. 132 kB
Download Defence's report PharmDr. Radim Kučera, Ph.D. 153 kB