velikost textu

Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Název v angličtině:
Bioactive molecules involved in blood processing by haematophagous monogeneans of the family Diplozoidae
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Jedličková
Školitel:
RNDr. Libor Mikeš, Ph.D.
Oponenti:
Mgr. Martin Horn, CSc.
RNDr. Dan Sojka, Ph.D.
Id práce:
145199
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra parazitologie (31-161)
Program studia:
Parazitologie (P1522)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
21. 10. 2019
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Čeština
Klíčová slova:
katepsin, peptidáza, proteáza, antikoagulant, hemolyzin, transkriptom, Eudiplozoon, Paradiplozoon
Klíčová slova v angličtině:
cathepsin, peptidase, protease, anticoagulant, haemolysin, transcriptome, Eudiplozoon, Paradiplozoon
Abstrakt:
Abstrakt Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly exprimovány v expresních systémech P. pastoris/E. coli a následně biochemicky a funkčně charakterizovány. Oba enzymy byly lokalizovány uvnitř trávicích buněk, ale i v lumen střeva dospělého červa. Výsledky tedy odhalily pravděpodobnou extracelulární fázi trávení krve u E. nipponicum a zároveň přítomnost široké škály katepsinů L s rozdílnými strukturními vlastnostmi a pravděpodobně i funkcemi. Vedle peptidáz účastnících se degradace přijatých krevních proteinů potřebují krevsající paraziti také bioaktivní molekuly zabraňující srážení nasávané krve. K regulaci hemostázy využívají často inhibitory serinových peptidáz účastnících se koagulační kaskády. Mezi ně patří např. inhibitory Kunitzova typu nalezené i v transkriptomu dospělců E. nipponicum. Jeden z nich (nazvaný EnKT1) byl vybrán pro heterologní expresi v systému E. coli. Rekombinantní EnKT1 inhiboval peptidolytickou aktivitu lidského faktoru Xa, plazminu a plazmového kallikreinu in vitro. Jeho antikoagulační aktivita založená na inhibici faktoru Xa byla potvrzena tromboelastograficky in vitro. Navzdory schopnosti inhibovat plazmin nebyl prokázán jeho vliv na fibrinolýzu. Na druhou stranu EnKT1 efektivně blokoval cytolytickou aktivitu rybího komplementu in vitro. Pomocí metod in situ hybridizace a imunohistochemie se podařilo EnKT1 lokalizovat uvnitř trávicích buněk parazita. Protein má sekreční signální sekvenci a byl detekován v E/S produktech parazita. Na základě uvedených vlastností se lze domnívat, že EnKT1 funguje jako bifunkční inhibitor blokující koagulaci přijaté krve ve střevě parazita a zároveň chránící buňky gastrodermis před útokem komplementu. Jedná se o první Kunitz protein parazitárního původu s prokázaným inhibičním účinkem na komplementovou kaskádu v krvi hostitele.
Abstract v angličtině:
Abstract Monogeneans from the family Diplozoidae (subclass Heteronchoinea) are bloodfeeding ectoparasites inhabiting gills of common carp. Digestion of blood in diplozoids is an intracellular process taking place in gut cells within lysosomal cycle in the presence of parasite's peptidases. However, information about the blood digestion comes only from ultrastructural and histochemical analyses. Therefore, I have focused in this work on biochemical and molecular characteristics of bioactive molecules which may participate in blood processing by E. nipponicum adults, especially cysteine peptidases of cathepsin L- and B- types, aspartic peptidases of cathepsin D-type, and Kunitz-type inhibitors of serine peptidases. In homogenates and excretory/secretory (E/S) products of E. nipponicum adults, an activity of cysteine peptidases of cathepsins L-type dominated, followed by an activity of cathepsin D-like aspartic peptidases and a minor cathepsin B-like activity. Inhibitors of the abovementioned peptidase types completely blocked hemoglobinolytic activity in the samples. In the transcriptome of E. nipponicum adults, ten cathepsin L-coding transcripts were found and only one cathepsin B-coding transcript. Primary structures of the encoded enzymes were bioinformatically and phylogenetically compared. Two abundant cathepsins L (EnCL1, EnCL3) were expressed in P. pastoris/E. coli expression systems and then biochemically and functionally characterized. Both enzymes were localized inside the gut cells and also in gut lumen of the adult worm. The results suggested probable extracellular phase of blood digestion in E. nipponicum and also the presence of a wide range of cathepsins L with different structural characteristics and also with likely different functions. In addition to peptidases participating in the degradation of blood proteins, haematophagous parasites also need bioactive molecules inhibiting coagulation during the blood intake. To regulate the haemostasis, they often use inhibitors of serine peptidases which participate in the coagulation cascade. These include, e.g., Kunitz-type inhibitors which were also found in the transcriptome of adult E. nipponicum. One of them (named EnKT1) was chosen for heterologous expression in E. coli system. Recombinant EnKT1 inhibited peptidolytic activity of human factor Xa, plasmin and plasma kallikrein in vitro. Its anticoagulation activity based on inhibition of factor Xa was confirmed in vitro by tromboelastography. Despite the ability to inhibit plasmin, its impact on fibrinolysis was not confirmed. On the other hand, EnKT1 effectively inhibited cytolytic activity of fish complement in vitro. By means of in situ hybridization and immunohistochemistry, the EnKT1 was localized inside the digestive cells of the parasite. It possesses a secretory signal sequence and was detected in E/S products of the worms. Based on these characteristics, we suppose that EnKT1 serves as a bifunctional inhibitor dininishing coagulation of ingested blood in the parasite's gut and, simultaneously, protecting cells of the gastrodermis from complement attack. It is the first example of a parasite-originated Kunitz protein with confirmed inhibitory effect on complement cascade in host’s blood.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Jedličková 9.21 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Jedličková 261 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Jedličková 261 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lucie Jedličková 800 kB
Stáhnout Posudek oponenta Mgr. Martin Horn, CSc. 130 kB
Stáhnout Posudek oponenta RNDr. Dan Sojka, Ph.D. 399 kB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby doc. RNDr. Ivan Hrdý, Ph.D. 154 kB