velikost textu

Novel binding proteins derived from small protein domains targeting diagnostically important molecules

Upozornění: Informace získané z popisných dat či souborů uložených v Repozitáři závěrečných prací nemohou být použity k výdělečným účelům nebo vydávány za studijní, vědeckou nebo jinou tvůrčí činnost jiné osoby než autora.
Název:
Novel binding proteins derived from small protein domains targeting diagnostically important molecules
Název v češtině:
Nové vazebné proteiny odvozené od malých proteinových domén cílené na diagnosticky využitelné terče
Typ:
Disertační práce
Autor:
Mgr. Lucie Marečková
Školitel:
RNDr. Petr Malý, CSc.
Oponenti:
doc. RNDr. Jiří Brynda, CSc.
Ing. Pavel Trefil, DrSc.
Id práce:
144294
Fakulta:
Přírodovědecká fakulta (PřF)
Pracoviště:
Katedra genetiky a mikrobiologie (31-140)
Program studia:
Biochemie (P1406)
Obor studia:
-
Přidělovaný titul:
Ph.D.
Datum obhajoby:
19. 12. 2018
Výsledek obhajoby:
Prospěl/a
Jazyk práce:
Angličtina
Klíčová slova:
proteinový scaffold, kombinatoriální knihovna, albumin vazebná doména, onkomarker, ribosomální displej
Klíčová slova v angličtině:
protein scaffold, combinatorial library, albumin-binding domain, oncomarker, ribosome display
Abstrakt:
Abstrakt Rychlý vývoj technik genového inženýrství, zejména metod pro in vitro řízenou evoluci a kombinatorickou mutagenezi, umožnil rychlý rozvoj nových vazebných proteinů pro téměř jakýkoli požadovaný antigen jako alternativu k dnes široce používaným protilátkám. Tyto tzv. scaffoldy jsou často odvozeny od malých proteinových domén s užitečnými biofyzikálními vlastnostmi. Zatímco na biofarmaceutickém trhu stále dominují monoklonální protilátky, možnost snadné cílené modifikace vazebných proteinů je předurčuje především pro použití v diagnostice. ABD scaffold, odvozený od albumin vážící domény streptokokového proteinu G tvořené třemi spojenými alfa-šroubovicemi, patří do rodiny malých vazebných domén. V naší laboratoři byla na základě ABD scaffoldu vyvinuta vysoce komplexní kombinatorická knihovna vazebných proteinů. Tato knihovna byla použita k selekci nových vazebných proteinů pro lidské sérové biomarkery rakoviny prostaty PSP94, KLK2, KLK11, jež mohou být použity k vývoji nových multifaktoriálních biosenzorů pro přesnější diagnostiku rakoviny prostaty. V druhé části dizertace je popsán vývoj vazebných proteinů odvozených od ABD scaffoldu určených pro selektivní rozpoznání různých fenotypů cirkulujících nádorových buněk jako součást mikrofluidního čipu vyvíjeného pro diagnostiku plicního adenokarcinomu. Vedle tohoto již osvědčeného modelu byly k selekci vazebných proteinů použity nově vyvinuté kombinatorické knihovny odvozené od Myomedinového scaffoldu, jehož odlišná struktura vazebného povrchu by mohla sloužit k rozpoznání jiných epitopů na cílových molekulách. Ve třetí části práce byla vytvořena sbírka unikátních vazebných proteinů odvozených od ABD scaffoldu a cílených na podjednotku B Shiga toxinu (Stx). Tyto varianty byly optimalizovány pro orientované vystavení na povrchu buněk Lactococcus lactis a funkčně charakterizovány. Po následném vylepšení vazebných vlastností některých vybraných variant by mohly takto upravené bakterie L. lactis sloužit k odstranění Stx z lidského gastrointestinálního traktu, a tím ke snížení účinku patogenních bakterií. Poslední část práce je zaměřena na vývoj unikátních polyvalentních vakcín pro imunizaci selat a telat proti střevním onemocněním. Současné vakcíny nabízejí jen omezený počet valencí a nenavozují ochranu proti některým závažným průjmovým onemocněním. Pro úspěšné uvedení vakcín na trh byly vyvinuty spolehlivé ELISA soupravy a protokoly pro ověření a validaci jejich kvality. Tyto ELISA sety jsou schopny detekovat sérové protilátky proti 10 faktorům patogenity a v současné době jsou používány v procesu validace před vstupem vakcín na trh ve 12 evropských zemích.
Abstract v angličtině:
Abstract The rapid development of the gene engineering techniques, especially methods for in vitro directed evolution and combinatorial mutagenesis, has triggered the generation of new binding agents to almost any antigen of interest as an alternative to broadly used antibodies. These so-called non-Ig scaffolds are often derived from proteins with useful biophysical properties. While the therapeutic market is still dominated by monoclonal antibodies, the easy option of desired customization of non-Ig binders by conventional methods of gene engineering predestine them largely for the use in the diagnostic area. The ABD scaffold, derived from a three-helix bundle of albumin-binding domain of streptococcal protein G, represents one of the small non-Ig scaffolds. In our laboratory, we have established a highly complex combinatorial library developed on the ABD scaffold. This ABD scaffold-derived library was used to generate unique binders of human prostate cancer (PCa) biomarkers PSP94, KLK2, KLK11 for the more precise diagnosis of PCa. The second part of the thesis describes the generation of ABD-derived binders selectively recognizing different phenotypes of circulating tumor cells as a binding component of the cell capture zone of microfluidic chip for lung adenocarcinoma diagnosis. Beside this already proven model, the newly developed libraries derived from the Myomedin scaffold were used to yield a novel type of binders that would recognize other cell-surface epitopes on target molecules. In the third part of the thesis, a collection of unique protein binders targeted to the Shiga toxin (Stx) B-subunit was generated with the use of ABD-derived combinatorial library. They were optimized for the surface display in Lactococcus lactis and functionally characterized. After subsequent improvement of the binding properties of particular S1B variants, Lactic acid bacteria with surface-displayed S1B binders would be useful for antagonizing pathogenic bacteria strains by the removal of Stx from the human gastrointestinal tract. The last part of the thesis is devoted to the development of unique polyvalent vaccines for immunization of piglets and calves against enteric diseases. Current vaccines offer only a limited number of valences and do not offer protection against some serious diarrheal diseases. For successful introduction of the vaccines to the market, precise and reliable ELISA kits and protocols for verification and validation of their quality were developed. This assay is able to detect serum antibodies against 10 factors of the pathogenicity and is currently being used as a crucial part of the validation process before these highly innovative vaccines enter the market in 12 European countries.
Dokumenty
Stáhnout Dokument Autor Typ Velikost
Stáhnout Text práce Mgr. Lucie Marečková 7.12 MB
Stáhnout Příloha k práci Mgr. Lucie Marečková 14.95 MB
Stáhnout Abstrakt v českém jazyce Mgr. Lucie Marečková 255 kB
Stáhnout Abstrakt anglicky Mgr. Lucie Marečková 251 kB
Stáhnout Autoreferát / teze disertační práce Mgr. Lucie Marečková 1.52 MB
Stáhnout Posudek oponenta doc. RNDr. Jiří Brynda, CSc. 91 kB
Stáhnout Posudek oponenta Ing. Pavel Trefil, DrSc. 1.98 MB
Stáhnout Záznam o průběhu obhajoby 1.06 MB